混菌固态发酵提高甘蔗叶酚类物质含量及抗氧化活性

阎欲晓，粟桂娇，何勇强

1. 广西大学生命科学与技术学院（南宁 530004）；2. 广西微生物与酶工程技术研究中心（南宁 530004）

甘蔗叶为植物甘蔗在种植和收获过程中产生的副产物，大部分被焚烧处理或做饲料使用，造成了资源的浪费和环境的污染[1]。许多报道显示甘蔗中富含具有抗氧化活力的酚类化合物[2-3]，甘蔗叶（梢）虽然只占甘蔗茎的小部分，但研究发现甘蔗中酚类物质多富集在甘蔗叶、鞘部位[4-5]，含量在0.5%～2%之间[6]，从经济和环境角度出发，利用农业残留物是生产酚类物质的较好选择。

植物酚类物质有游离态和结合态两种形式，游离态酚类物质易溶于水和有机溶剂，而结合态酚类物质通过糖苷键、酯键等与其他物质结合，较难萃取[7-8]。有机溶剂萃取法是目前提取甘蔗叶酚类物质常用的方法，但研究表明，甘蔗叶中含量较高的咖啡酸、阿魏酸、香豆酸等多酚物质都与细胞壁中的纤维素、木质素结合在一起[9]，有机溶剂不能破坏这些结合，导致提取率偏低。

近年来，混菌固态发酵常用于提高植物酚类物质的释放，通过发酵过程中菌体代谢产生的纤维素酶、木质素分解酶等复合酶系的互补性和协同性，将植物细胞壁上的木质素、纤维素水解，破坏纤维致密结构，使结合状态的黄酮、多酚释放出来[10-11]，显著提高植物中酚类物质的含量和抗氧化性。

此次试验利用米曲霉和黑曲霉混合菌种对甘蔗叶进行固态发酵，研究发酵过程中甘蔗叶黄酮、多酚的含量和抗氧化活性的变化情况，并对代谢产生的β-葡萄糖苷酶和纤维素酶活性进行测定，探索这2种水解酶活力与酚类物质释放的关系，为甘蔗叶酚类物质的高效提取提供依据。

1 材料与方法

1.1 主要材料与试剂

甘蔗叶：采摘于甘蔗种植田，烘干粉碎过12目（1.7 mm孔径）筛；米曲霉GXU01、黑曲霉GXU06菌种：广西大学生命科学与技术学院筛选保藏；对硝基苯酚（p-Nitrophenol，p-NP）、对硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷（p-Nitrophenyl-β-D-glucopyranoside，p-NPG）、1, 1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）：均为分析纯，美国Sigma公司；其余试剂均为国产分析纯。

1.2 主要仪器与设备

3-18K高速冷冻离心机（德国Sigma公司）；UVmini-1240紫外分光光度计[岛津企业管理（中国）有限公司]；Elx80全自动酶标仪（美国Biotek Instruments公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 种子液的制备

分别将米曲霉、黑曲霉菌种接种到PDA斜面培养基，于30 ℃培养4 d，制成孢子悬液后将各菌液以10%的接种量接入种子培养液，在120 r/min，30 ℃条件下培养12 h。

1.3.2 米曲霉/黑曲霉固态发酵单因素试验

以甘蔗叶65%、麸皮35%为基础培养基，研究培养基含水量（40%，50%，60%，70%和80%）、接种量（9%，18%，27%，36%和45%）、混菌比例（3∶1，2：1，1∶1，1∶2和1∶3 mL/mL）、发酵时间（2，3，4，5和6 d）因素对黄酮、多酚含量的影响

1.3.3 米曲霉/黑曲霉固态发酵正交试验

在单因素试验基础上，采用四因素三水平正交试验L9(34)对发酵条件进行优化。

表1 因素水平表L9(34)

1.3.4 酚类物质含量测定

黄酮含量测定：采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH比色法，参照文献[12]方法测定。

多酚含量测定：参照GB/T 8313—2018《茶叶中茶多酚和儿茶素类含量的检测方法》测定。

1.3.5 酶活力测定

β-葡萄糖苷酶活力：将酶液20 μL与20 μL 20 mmol/Lp-NPG溶液混合，加入160 μL磷酸缓冲液（pH 5.5），于37 ℃反应20 min后加入50 μL 2 mol/L Na2CO3溶液终止反应，在405 nm波长下测定吸光读。在反应条件下，1 g发酵甘蔗叶1 h水解p-NPG产生1 μmolp-NP所需酶量为一个酶活单位。

纤维素酶活力测定：将0.5 mL酶液与1% 1.0 mL CMC-Na混合，于50 ℃保温30 min，加入3 mL DNS试剂，煮沸5 min后定容至20 mL，在540 nm波长下测定吸光读。在反应条件下，1 g发酵甘蔗叶1 h分解纤维素产生1 μmol葡萄糖所需酶量为一个酶活单位。

1.3.6 抗氧化能力测定

按照文献[13]进行羟自由基和DPPH自由基清除试验。

1.4 数据处理及统计分析

2 结果与分析

2.1 米曲霉/黑曲霉混菌固态发酵单因素试验

2.1.1 培养基含水量的影响

由图1可知，随着含水量的增加，黄酮和多酚的质量分数有上升趋势，在含水量为60%时，黄酮和多酚质量分数均达到最大，但当含水量提高到70%和80%时，固态培养基发生结块，菌体缺氧导致发酵受抑制，黄酮和多酚质量分数明显下降。该结果与文献报道含水量对真菌发酵银杏叶[14]和红曲霉发酵番石榴叶[15]提取黄酮、多酚的结果相似。

图1 培养基含水量对黄酮和多酚质量分数的影响

2.1.2 混菌接种量的影响

由图2可知：随着接种量的上升，黄酮、多酚的质量分数显著上升，在接种量为36%时黄酮质量分数达到最大值，为7.09 mg/g，是对照组的1.28倍；在接种量为18%时，多酚质量分数达到最大，为7.04 mg/g，是对照组的1.24倍；再增加接种量，黄酮、多酚的质量分数都会下降。在一定接种量范围内，随着接种量的增加，菌体代谢产生的水解酶会破环甘蔗叶细胞壁结构，使黄酮和多酚从结合态转变为游离态，增加了黄酮和多酚的释放量，但接种量过大，抑制了菌体生长和产酶活力，导致提取率降低。

图2 混菌接种量对黄酮和多酚质量分数的影响

2.1.3 菌种比例的影响

由图3可以看出，随着米曲霉所占比例降低，黑曲霉比例增加，黄酮和多酚质量分数先增加后降低，当米曲霉∶黑曲霉比例为1∶2时，含量均达到最高点。原因可能是米曲霉∶黑曲霉为1∶2比例时，两种菌发挥协同作用最佳，分泌的水解酶系最多，最有利于结合态酚类物质释放和溶出。

图3 混菌接种比例对黄酮和多酚质量分数的影响

2.1.4 发酵时间的影响

由图4可知：随着发酵时间的延长，甘蔗叶黄酮和多酚的质量分数均呈现先增加后下降的趋势，在发酵第3和第4天两者达到最大值，此时微生物分泌的水解酶活力最强，细胞壁对酚类化合物溶出的阻滞作用最小，从而游离态黄酮和多酚质量分数上升；但随着发酵时间的增长，发酵后期微生物会分泌某种酶将游离酚类化合物降解或聚合，反而导致酚类物质的含量有所下降[16-17]。

图4 发酵时间对黄酮和多酚质量分数的影响

2.2 米曲霉/黑曲霉混菌固态发酵正交试验

对正交试验数据进行分析处理，结果见表2。

由表2可以看出，对发酵甘蔗叶中黄酮和多酚质量分数的影响程度为含水量＞发酵时间＞菌种比例＞接种量。结合黄酮、多酚质量分数k值进行综合分析，其最佳工艺条件为A2B1C2D2，即接种量45%、培养基含水量40%、米曲霉与黑曲霉比例为1∶2、发酵时间4 d。在此条件下进行发酵试验，测得黄酮质量分数为8.35 mg/g，比未发酵甘蔗叶中黄酮质量分数提高了50.72%，多酚质量分数为8.54 mg/g，比未发酵样品中多酚质量分数提高了50.62%。

表2 正交试验结果

2.3 发酵过程中酚类物质含量与水解酶活性的相关性

2.3.1 混菌发酵对水解酶活性影响

为了研究发酵过程中酚类物质含量变化与相关水解酶活力的关系，对发酵过程中酶活力进行了测定。从图5可知，在甘蔗叶发酵过程中纤维素酶的活力均高于β-葡萄糖苷酶的活力，发酵前期两种酶的活力均不断增加，在发酵第3天达到最大，分别为585.88 U/g和136.68 U/g，随着发酵时间延长酶活力有所下降。

图5 发酵过程中酶活力变化

2.3.2 黄酮、多酚质量分数与水解酶活力的相关性

黄酮、多酚的释放量与两种水解酶活力的相关性分析如表3所示。2种水解酶活力与黄酮和多酚质量分数呈现显著正相关，推测在发酵过程中，纤维素酶首先破坏植物细胞壁结构，使游离黄酮、多酚溶出，并将结合态酚类物质中的糖苷键和酯键暴露，有利于β-葡萄糖苷酶和纤维素酶等复合水解酶系进行水解，使结合态多酚转变为游离态多酚溶出[18]。

表3 黄酮、多酚质量分数与酶活力的相关系数

2.4 发酵甘蔗叶抗氧化活性

2.4.1 发酵/未发酵甘蔗叶提取物对DPPH自由基清除能力

从图6可知，相同浓度下发酵甘蔗叶提取物对DPPH自由基清除率均比未发酵甘蔗叶提取液高，从IC50值比较，未发酵甘蔗叶样品的IC50为37.40 μg/mL，而发酵甘蔗叶样品的IC50下降为32.64 μg/mL，也说明发酵后甘蔗叶中酚类物质抗氧化能力得到提高。

图6 发酵/未发酵甘蔗叶提取物对DPPH自由基清除能力

2.4.2 发酵/未发酵甘蔗叶提取物对羟自由基（·OH）清除能力

由图7可知，发酵/未发酵甘蔗叶提取物对羟自由基均有一定的清除能力，且表现出明显的量效关系。发酵甘蔗叶样品的IC50值为174.13 μg/mL，未发酵甘蔗叶样品的IC50值为280.25 μg/mL，表明发酵后甘蔗叶提取物清除羟自由基的能力显著提高，但略低于维生素C（IC50值为161.90 μg/mL）。

图7 发酵/未发酵甘蔗叶对羟自由基的清除能力

3 结论

利用米曲霉和黑曲霉混合菌种对甘蔗叶进行固态发酵，可以提升甘蔗叶中的黄酮、多酚的质量分数。在发酵温度30 ℃、基质含水量40%、总接种量45%、米曲霉与黑曲霉接种比例1∶2的条件下固态发酵4天，黄酮质量分数为8.35 mg/g，比未发酵甘蔗叶提高了50.72%，多酚质量分数为8.54 mg/g，比未发酵样品中多酚质量分数提高了50.62%。

在混菌固态发酵过程中，黄酮、多酚质量分数变化与β-葡萄糖糖苷酶和纤维素酶活性变化呈显著正相关。

通过DPPH自由基和羟自由基体外清除试验，结果发现发酵甘蔗叶产物对DPPH自由基和羟自由基的清除能力比未发酵甘蔗叶有良好的上升趋势，说明经过混合菌种固态发酵后甘蔗叶酚类物质的抗氧化能力得到了提高。