复合酶辅助提取杜仲叶多酚及其应用

柯文林，杨韧强

福建中烟工业有限责任公司（厦门 361012）

杜仲的果实因其鲜美的风味和营养价值而被用作功能性饮料的来源。除了果实，其叶也有很多用途。在巴西和中国，杜仲叶被广泛用作功能性凉茶或饮料的来源，含有各种生物活性化合物，包括酚酸、黄酮类化合物和多糖。其中，多酚具有较强的抗氧化活性，多酚类化合物是EL资源中最丰富的生物活性成分之一。

有研究表明，植物基质的酚类化合物通常以可溶性游离、可溶性共轭和不溶性结合的形式存在。Madhujith等[1]证实大麦中不溶性结合和可溶性共轭酚类物质的含量高于游离酚类物质的含量。有研究表明，不溶性结合的酚类物质占玉米、小麦、米糠和茶叶产品中总酚的65%以上[2]。研究还证实：不溶结合的酚类物质由于其通过细胞壁中的O—糖苷键或C—糖苷键与多糖或蛋白质结合，难以提取；萃取溶剂对促进不溶性结合酚类物质的释放没有显著影响[3]。多种方法被用于改善农副产品中酚类成分的释放，如加压液体萃取、超临界流体萃取、微波或超声辅助萃取、水热萃取和远红外辐射。这些提取方法的优点是可以提高提取率，缩短提取时间[4-6]。然而，这些方法存在设备昂贵、规模小和环境污染等缺点，严重阻碍了它们在农副产品中的应用。因此，随着市场对酚类提取物的需求不断增加，促使人们寻找新颖、生态友好和有效的提取方法，以提高其回收率和生物利用度。酶辅助提取在提高植物基质酚类物质含量方面具有规模大、效率高、环保等优点。

试验研究不同酶辅助提取方法对改善EL中不溶性结合酚类物质释放的能力；表征酶辅助提取后EL中游离、可溶性共轭和不溶性结合形式中单个酚类物质的组成和含量的变化；考察复合酶辅助多酚杜仲叶提取物在卷烟中的应用效果，利用自主调香手段，对杜仲叶多酚提取物的香气特征和质量特征进行优化，为开发高品质、实用性杜仲叶多酚提取物产品提供参考。

1 材料与方法

1.1 试剂与材料

干燥杜仲叶，从河南太康农场获得。

所有酚类标准品、Folin-Ciocalteu的苯酚试剂、过硫酸钾、FeCl3、Trolox、ABTS、2, 4, 6-三吡啶-三嗪（TPTZ）、DPPH（＞99.5%），均购自Sigma-Aldrich；甲酸、乙腈溶剂，HPLC级，99.9%，均购自Fisher Scientific；黑曲霉纤维素酶（E.C.3.2.1.4，8 000 U/g）、木聚糖酶（E.C.3.2.1.8，8 000 U/g）、里氏木霉β-葡萄糖苷酶（E.C.3.2.1.21，8 000 U/g）、复合酶（包括纤维素酶、木聚糖酶和β-葡萄糖苷酶），均购自Youtell Biochemical公司（上海）。

1.2 酶预处理

酶促反应体系包括5 g干燥和研磨的EL底物和20 mL H2O（用0.02 mol/L柠檬酸调节至pH 5.0），在50℃下分别用0.5 g单酶（纤维素酶、木聚糖酶或β-葡萄糖苷酶）或1.5 g复合酶混合物（纤维素酶∶木聚糖酶∶β-葡萄糖苷酶=1∶1∶1）培养12 h。酶处理1式3份。反应完成后，所有样品在80 ℃烘箱中保持20 min使这些酶失活。收集不同酶处理的EL样品，在60 ℃下干燥15 h，除去水分。

1.3 游离酚类组分的提取

1 g预处理后的EL粉末，用70%甲醇以1∶10（g/mL）的比例进行提取。每次萃取，混合物在40 ℃水浴中保存1 h。滤液用70 mL乙酸乙酯经液-液分层萃取3次。乙酸乙酯去除后，提取物在5 mL 50%甲醇（V/V）中重新溶解。

1.4 可溶性共轭酚类物质的提取

游离酚类组分乙酸乙酯萃取后，从水相中提取共轭酚类组分。用40 mL的2 mol/L NaOH水解4 h，用12 mol/L HCl酸化至pH 2.0。用70 mL乙酸乙酯进行液液分层，对水解物进行3次萃取。乙酸乙酯馏分在45℃下真空蒸发至干燥，提取液在50%甲醇（V/V）的5 mL中再溶解。

1.5 不溶性结合酚类的萃取

将上述游离酚类物质提取的干燥叶渣（0.5 g）在室温下用50 mL的2 mol/L NaOH直接水解4 h，用12 mol/L HCl酸化为pH 2.0。用70 mL乙酸乙酯提取3次剩余的混合物。乙酸乙酯组分在45 ℃真空下蒸发直到干燥。将不溶结合的酚类物质加入5 mL的50%甲醇（V/V）溶解。所有酚类提取物在分析前在-20 ℃处存放。

1.6 酚含量的测定

100 μL酚类提取物与30 μL的Folin-Ciocalteu试剂及150 μL的20% Na2CO3溶液混合。在黑暗处30 ℃培养30 min后，用Spectra Max Gemini microtiter plate reader（分子设备，Sunnyvale，CA，USA）在760 nm处测量吸光度。以没食子酸（10～100 μg/mL）为参比标准（R2=0.999 5）。酚类含量以mg没食子酸当量（GAE）/g样品干质量（DM）（mg GAE/g DM）表示。样品测定1式3份。

1.7 黄酮类化合物含量的测定

用AlCl3比色法测定黄酮类化合物的含量。将0.1 mL上述提取物被放置在1支2 mL的Eppendorf试管中。加入70%甲醇溶液制成0.5 mL溶液，加入30 μL 5%NaNO2溶液。室温保存5 min后，加入10% AlCl3溶液30 μL，静置6 min。加入0.2 mL的1 mol/L NaOH用70%甲醇溶液将总体积增加到1 mL。溶液再次彻底混合，在35 ℃下静置30 min。在510 nm处读取吸光度。以芦丁（10～100 μg/mL）为参考标准（R2=0.999 5）。黄酮类化合物含量以mg芦丁当量（RE）/g样品干燥重量（DM）（mg RE/g DM）表示。所有样品测定1式3份。

1.8 HPLC分析

HPLC系统为Waters e2695，分析柱为Waters SunFireTMC18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相由0.1%甲酸水溶液（V/V，溶液A）和乙腈溶液（溶液B）组成，以0.8 mL/min的梯度洗脱，随时间增加，0～5 min，15% B相，5～10 min 15%～20% B相，10～20 min 20%～25% B相，20～30 min 25%～35% B相，30～40 min 35%～50% B相，40～50 min 80% B相，50～55 min 15% B相。柱温设定为300 ℃。DAD检测波长设置为280 nm。在HPLC分析之前，样品通过0.25 μm膜过滤器（Millipore，Billerica，MA，USA）过滤。EL样品中，单个酚类物质含量以mg/100 g DM进行表示。

1.9 统计分析

所有试验重复3次，数据表示为平均值±标准差（SD）。数据采用SPSS统计13.0软件进行分析。采用单因素方差分析（ANOVA）方法，评价检验水平均值差异的显着性。p＜0.05和p＜0.01分别表示差异显著和高度显著。

2 结果与讨论

2.1 酶辅助提取法下总酚和黄酮含量的变化及影响分析

不同酶辅助提取方法的EL提取物中可溶性游离多酚（FP）、可溶性共轭多酚（SCP）、不溶性结合多酚（IBP）和总多酚（TSP）的含量如图1所示。单纤维素酶辅助提取（CAE）后，FP、SCP、IBP和TSP的产率分别为19.4，13.3，22.0和27.1 mg GAE/g DM。与未处理（CK）相比，FP、SCP和TSP含量分别提高37.6%，30.1%和34.8%。单木聚糖酶辅助提取（XAE）对酚类含量无显著影响（p=0.134）。单β-葡萄糖苷酶辅助提取（GAE）也显著增加FP、SCP和TSP含量，比对照组CK高1.6，1.8和1.7倍（p=0.000）。此外，复合酶辅助提取（CEAE）明显提高FP、SCP和TSP含量，比对照组提高1.9，2.2和2.0倍，IBP的含量降低59.17%。在对照组CK中，FP与TP的比例仅35.7%。然而，CEAE后，该比率增加到了1.3。相应的IBP从对照组CK的42.4%下降到CEAE组的13.1%。

图1 不同处理方式下不同结合态多酚类化合物含量

图2显示EL提取物中FF、SCF、IBF和TSF的含量。在CAE后，FF、SCF、IBF和TSF的含量分别为17.5，15.4，22.3和30.2 mg RE/g DM。与对照组CK相比，FF、SCF和TSF分别增加19.2%，13.3%和12.7%。XAE对TSF含量无显著影响（p=0.211），但GAE显著增加FF、SCF和TSF的含量，比未处理组多1.5，1.3和1.5倍（p=0.001）。此外，CEAE明显增加FF、SCF和TSF的含量，比未处理组增加2.1，1.4和1.8倍，IBP含量降低73.6%。FF对总酚类物质的贡献从CK组的37.2%增加到CEAE组的63.5%，而相应的IBF从CK组的39.8%下降到CEAE组的8.7%。

图2 不同处理方式下不同结合态黄酮类化合物含量

可溶性酚类物质容易从植物基质中释放出来，而不溶性结合的酚类化合物的提取困难。不溶性结合形式的酚类化合物与植物细胞壁结构元素如纤维素、半纤维素和结构蛋白或多糖共价结合。试验证实木聚糖酶辅助提取对提高可溶性酚类物质和黄酮类化合物（游离和共轭形式）的产率没有显著影响。然而，纤维素酶或者β-葡萄糖苷酶辅助提取增加不溶性结合酚类物质和黄酮类化合物的释放。此外，复合酶辅助提取是一种更高效的方法，可以提高不溶性结合酚类物质的释放，获得比单一酶辅助提取产生较高的酚类物质含量。

复杂的酶辅助提取比使用单一的酶辅助提取更有效，这与以前的研究是一致的[2,7-8]。这一点是因为EL是由许多黄酮类化合物，以糖苷键或OH基形式附着在细胞壁、多糖或蛋白质上而组成的。许多报道证实β-葡萄糖苷酶和纤维素酶可以更有效地破坏键（糖苷键或—OH）。然而，木聚糖酶可能在酚类物质与植物基质细胞壁之间的键破裂中起着少数作用。已有证实了与红曲霉和酿酒酵母的固态共发酵增强EL的酚类含量，但游离、共轭和不溶性结合酚类物质的变化与不溶性结合酚类物质的释放和发酵过程中的酶作用之间的关系尚不清楚[6,9]。因此，对EL中的酚类物质进行综合评价是很重要的，包括在特定的酶辅助提取下，游离、共轭和不溶性结合的酚类物质的变化。

2.2 酶辅助提取下酚类化合物的变化

分析EL辅助提取后的15种酚类化合物，包括没食子酸、对香豆酸、绿原酸、对羟基苯甲酸、芥子酸、咖啡酸、阿魏酸、芦丁、异槲皮苷、槲皮素-3-O-β-D木糖吡喃苷、槲皮素-3-O-α-L-阿拉伯糖苷、木耳素、槲皮苷、槲皮素和山奈酚（图3）。在HPLC分析基础上，酶辅助提取物后3种酚类组分的组成相似，但含量有明显差异（p＜0.05）。从图3（B和C）及表1可以发现，槲皮素-3-O-β-D木糖吡喃苷和山奈酚仅以可溶性游离形式存在，而绿原酸、芦丁、芥子酸、牛磺酸和槲皮素很少作为可溶性共轭形式存在。大多数测定的酚类物质以游离、可溶性共轭和不溶性结合形式存在（图3 B～D）。在CAE后，除丁香酸和铁酸外，EL提取物中的单个酚类物质含量略有增加，但不显著（p=0.39）。经XAE后，EL提取物中单一酚类化合物含量无明显变化（p=0.43）。

图3 不同酶辅助提取方法色谱图

用β-葡萄糖苷酶处理也能明显提高单个酚类物质的总可溶性含量，特别是没食子酸和槲皮素的可溶性含量，分别提高35.3%和155.2%，而芦丁、牛耳苷和槲皮素-3-O-α-L-阿拉伯糖苷分别降低71.6%，71.8%和20.3%。EL提取物中每种酚类化合物含量提取物在CEAE处理后的含量增加情况为桂酸56.8%、绿原酸36.2%、对羟基苯甲酸85.1%、咖啡酸86.9%、对香豆酸75.1%、槲皮素-3-O-β-D木糖吡喃苷36.4%、槲皮苷26.7%、槲皮素251.6%、山铁素121.7%，此外，4种酚类化合物总含量下降，分别为丁香酸68.1%、芦丁88.7%，槲皮素-3-O-α-L-阿拉伯糖苷81.8%和木耳素92.5%。

2.3 酶辅助提取对酚类物质组成的作用

一般来说，CAE增加EL中单个酚类化合物的可溶性含量，但丁香酸除外，该酸明显下降，这可能是由于暴露于高温下的降解所致。GAE不仅可以促进酚类化合物的释放，而且还可以将黄酮苷转化为苷元。GAE从EL中释放槲皮素199.1 mg/100 g DM，而CEAE增加到258.9 mg/100 g DM，是对照的3.5倍。槲皮素含量的显著提高是由于植物细胞壁损伤所产生的酶效应与槲皮素-3-O-α-L-阿拉伯糖和牛耳素的生物转化相互作用所致。有趣的是，CEAE带来比单一酶处理更大的单个酚类物质的释放，EL提取物中可溶性游离酚类物质大于可溶性共轭和不溶性结合形式[10-11]。研究还发现，纤维素酶和α-淀粉酶处理释放的可溶性共轭物比游离酚酸更多，包括阿魏酸、香豆酸、咖啡酸和香草酸，并且释放量在测试酶之间有显着性差异[3,12]。总之，一些个别酚类物质的释放方式不同，是由于它们不同细胞壁成分的附着，以及酶的特异性。

3 酶辅助杜仲叶提取物在卷烟应用中评价

3.1 不同形态多酚杜仲叶提取物的评价

将按优化的复合酶预处理法提取杜仲叶多酚添加至卷烟中，对其在卷烟中的作用进行感官评价，评价结果如表1。采用复合酶预处理法提取的可溶性结合态多酚杜仲叶提取物在中间香型卷烟叶组中的表现最好，能增加清香香韵，提升香气质感，甜感舒适自然；游离态多酚杜仲叶提取物会拉低烟香的清晰明亮度，且烟气偏粗；不可溶性结合态多酚杜仲叶提取物在卷烟中应用虽增加烟气浓度，但风格特征较弱，口腔干燥，口感稍欠。因此在添加量0.05%的中间香型卷烟叶组中可溶性结合态多酚杜仲叶提取物具有良好应用效果。

表1 复合酶提取杜仲叶多酚提取物在卷烟中的感官评价结果

3.2 可溶性结合态多酚杜仲叶提取物的香味特征优化

复合酶酶预处理法提取的可溶性结合态多酚杜仲叶提取物能增加卷烟的青香香韵，提升香气质感，甜感舒适自然，这方面的作用对于提取物来说较有优势，但是杜仲叶提取物因原料价格及提取率的限制，单独使用成本较高。在香基的基础上，通过复合酶预处理法提取的可溶性结合态多酚杜仲叶提取物对其香原料自然感进行修饰，并用体现烟草本香（巨豆三烯酮、茄酮）、清香及清甜香（苯乙醇、β-大马酮、树兰花油、春黄菊油）等原料对烟草香及清香、花香进行衔接，获得复配的可溶性结合态多酚杜仲叶提取物。

调香试验及不同比例配方的感官评价结果如表2和表3所示。DZYTQW-1的清甜香韵稍有增加，甜香较明显，香气质提升，烟气较细腻柔和，但清香、清甜香韵不够明显，烟草本香底蕴和厚实感也稍欠，且略有花粉气息；在DZYTQW-1配方的基础上，通过增加茄酮和巨豆三烯酮的用量提升烟草底蕴质感，增加可溶性多酚杜仲叶提取物、大马酮和春黄菊油的比例来增强烟香的自然感、厚实度和掩盖杂气，降低树兰花油和苯乙醇的含量来减少花粉气息形成配方DZYTQW-2，该配方清香、清甜香韵增加明显，烟草底蕴厚实饱满，但烟香略显粗糙，余味欠干净，且透发性不够。再次适当减少茄酮和巨豆三烯酮的用量形成DZYTQW-3配方，该配方的清香、清甜香韵增加明显，香气甜醇、质感提升且与烟草本香协调性好，烟气丰满又醇和细腻，较飘逸透发，余味干净舒适自然。

表2 可溶性结合态多酚杜仲叶提取物配方

表3 不同配方的可溶性结合态多酚杜仲叶提取物感官评价结果

4 结论

试验表明，单木聚糖酶辅助提取不改变EL中可溶性酚类物质的组成和产率。单纤维素酶或β-葡萄糖苷酶辅助提取显著提高EL的可溶性酚类物质含量。同时，复合酶辅助提取不仅提高EL中可溶性酚类物质的产率，且大部分酚类物质以可溶性形式存在，很少以不溶结合的形式存在。还能将黄酮苷元转化为具有较强抗氧化活性的黄酮苷（槲皮素和山奈酚）。更重要的是，CEAE后EL的总可溶性酚类提取物，显示最高的抗氧化活性和超螺旋DNA抗损伤的保护作用。利用复合酶对杜仲叶可溶性结合态多酚提取能力较强，所得可溶性结合态多酚杜仲叶提取物可以增加卷烟清香韵，提升烟气细腻柔和度及香气质感，改善口感。因此复合酶辅助提取法作为杜仲叶多酚提取物的前处理方法具有优势。通过对体现烟草本香、清香及清甜香等原料的筛选，对杜仲叶多酚的香味特征进行修饰优化，将为EL加工成以多酚为基础的食物来源或杜仲叶产品提供有用信息，提升产品品质和实用性，且获得的产品更具健康益处。总之，复合酶辅助提取技术可用于从植物基质中提取生化成分，在烟草和制药工业中具有良好的应用潜力。