发酵法制备萝卜硫素的工艺优化

阳晖*，卢凌霄，王晴，张川雨，曹沁倩，周先容

长江师范学院现代农业与生物工程学院（重庆 408100）

萝卜硫素是一种异硫代氰酸盐衍生物，是迄今为止蔬菜中发现的最强的抗癌成分[1]。因此，在药品和保健食品行业大规模生产萝卜硫素产品具有广阔的市场应用前景。但萝卜硫素现有的提取方法较为单一，且存在过程难以控制、操作复杂和成本较高的问题，因此还需探究一种新的方法来制备萝卜硫素。

现有的萝卜硫素制备方法主要包括化学合成法、半合成法和酶法[2]，化学合成法反应过程容易控制，产量高，但是一般使用有毒试剂为原料，易造成环境污染，且工艺复杂，副产物多，产率低[3]，徐倩等[4]公开了一种萝卜硫素的化学合成方法。酶解法主要是利用植物中的黑芥子甘酶酶解萝卜硫素前体物质-萝卜硫苷，酶法条件温和，成本较低，但影响因素多，得率低。吴元锋等[5]用酶解法来提取芸薹属植物种子中的萝卜硫素。谢述琼等[6]研究了从西兰花种子中酶解浸提萝卜硫素的工艺。近年来，肠道中的微生物对硫代葡萄糖苷的降解作用和途径越来越受到关注[7]。因此，可尝试利用微生物降解萝卜硫素的前体物质-硫代葡萄糖苷来获得萝卜硫素。发酵法较化学合成法来讲工艺更简单，反应条件更容易控制；与酶解法相比，由于微生物的繁殖能力、产酶能力都极强，条件易于控制，因此采用微生物发酵制备萝卜硫素成本更低、产率更高。

试验以胭脂萝卜为原料，采用发酵法制备胭脂萝卜硫素，比较了枯草芽孢杆菌、黑曲霉、大肠杆菌降解硫代葡萄糖苷的效果，优化了发酵法制备萝卜硫素的工艺条件，为萝卜硫素的工业化生产提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

胭脂萝卜、土豆，市售；黑曲霉CMCC（F）98003、枯草芽孢杆菌 CMCC（B）63501、大肠杆菌CMCC（B）44102，上海鲁微科技有限公司；牛肉膏、琼脂、蛋白胨，北京奥博星生物技术有限责任公司；葡萄糖、无水乙醇、乙酸乙酯、氯化钠，天津市大茂化学试剂厂；硝酸银、抗坏血酸，上海国药集团试剂有限公司；氢氧化钠，天津博迪化工股份有限公司。

SB-5200 DTD超声波清洗机（宁波新芝生物科技股份有限公司）；T6新世纪紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）；ZHJH-C1112C超净工作台、ZHWY-200B恒温培养振荡器、ZFD-5040全自动鼓风干燥箱（上海智城分析仪器制造有限公司）；DI54DWS自动压力蒸汽灭菌器[致微（厦门）仪器有限公司]；SHP-250DF生化培养箱（上海森信实验仪器有限公司）；EL204电子分析天平[梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司]；HH-4数显恒温水浴锅（江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司）；XD-52AA旋转蒸发仪（上海贤德实验仪器有限公司）；SHZ-D水循环式真空泵（上海予英仪器有限公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 工艺流程

1.2.2 操作要点

1.2.2.1 胭脂萝卜的前处理

清洗新鲜的胭脂萝卜，切丝后匀浆，放入50 ℃干燥箱干燥至无水，然后研磨至粉状。

1.2.2.2 胭脂萝卜培养基的制作

将研磨胭脂萝卜放入三角瓶中，在121 ℃下灭菌15 min，在无菌环境下加入适量无菌水，制成胭脂萝卜培养基。

1.2.2.3 种子培养基的制作

将黑曲霉接种到PDA培养基[8]上，于30 ℃培养24 h；将枯草芽孢杆菌和大肠杆菌接种到牛肉膏蛋白胨培养基于37 ℃培养24 h，使菌种活化，再分别传代培养两次，制成种子培养基。然后，将培养好的菌种用100 mL 0.85%生理盐水洗出，放入灭菌后的锥形瓶中振荡均匀，备用。

1.2.2.4 发酵

将培养好的菌种按一定接种量接种于胭脂萝卜培养基中使其发酵相应的时间后，于50 ℃干燥至基本无水分为止。

1.2.2.5 萝卜硫素的提取

按液料比30∶1（mL/g）加入乙酸乙酯，超声提取25 min，在25 ℃下放置2 h，将提取后的混合液抽滤2次[9]。将提取液在40 ℃旋转浓缩至基本无乙酸乙酯为止，用少量提取剂将产物洗涤出来，再用分液漏斗将其分离。

1.2.2.6 萝卜硫素定性分析

在萝卜硫素粗提物中加入过量硝酸银，生成不溶解的硫化银和碳化二亚胺，即棕黑色沉淀，则表明提取物中存在萝卜硫素[10]。

1.2.2.7 萝卜硫素定量分析

采用紫外分光光度法进行定量[11]。精确称取1 mg萝卜硫素标样，再取10 mL的无水乙醇溶液将其配成质量浓度为0.10 mg/mL的标准溶液。按照浓度梯度配制0.04，0.05，0.06，0.07，0.08，0.09和0.10 mg/mL的标准溶液，依次在波长201 nm处测定其吸光度，测3次，求平均值。然后以所得吸光度为纵坐标，以萝卜硫素测定的质量浓度（mg/mL）为横坐标建立标准曲线。标准曲线的相关系数为R2=0.993 4，线性方程为y=0.642 9x-0.017 1，如图1所示。由此线性方程计算出粗提物中萝卜硫素浓度。萝卜硫素提取量（mg/g）按式（1）计算。

图1 萝卜硫素标准曲线

1.2.3 单因素试验

1.2.3.1 发酵菌种的选择与确定

Smits等[12]从黑曲霉中检测出具有黑芥子酶活性，黑芥子酶是将硫代葡萄糖苷降解为异硫氰酸酯的酶[7]。何荣海等[13]指出枯草芽孢杆菌可降解硫代葡萄糖苷，虽未明确降解产物中是否具有异硫氰酸酯的产生，但枯草芽孢杆菌生理特征丰富多样，分布广泛，易分离培养，对人畜无毒害，不污染环境，能产生多种抗菌素和酶[14]。Getahun等[15]通过对志愿者尿液标记试验证明人体肠道中的某些微生物可降解硫代葡萄糖苷并生成异硫氰酸酯及其衍生物，故选用人体肠道中最主要且数量最多的大肠杆菌作为备选菌种。分别用黑曲霉、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌进行接种发酵，对其发酵结果进行定性分析，最终选取发酵效果最好的菌种进行单因素试验。

1.2.3.2 发酵条件对制备萝卜硫素效果的影响

在发酵温度30 ℃、液料比3∶1（mL/g）、接种量6%，pH 5.5的4因素中3个因素固定不变的情况下，分别比较不同的发酵时间（24，48，72，96和120 h）、不同的发酵温度（20，25，30，35和40 ℃）、不同的发酵液料比（1∶1，2∶1，3∶1，4∶1和5∶1 mL/g）、不同的接种量（2%，4%，6%，8%和10%）和不同pH（4.5，5.5，6.5，7.5和8.5）对萝卜硫素提取量的影响。

1.2.4 响应面试验设计

根据单因素试验结果，采用Design Expert 8.0软件设计响应面[16]，以发酵温度、液料比、接种量、发酵pH作为响应因子，以萝卜硫素提取量作为响应值，确定发酵法制备萝卜硫素的最佳工艺条件，水平因素设计见表1。

表1 响应面设计水平因素表

2 结果与分析

2.1 发酵菌种的确定

选用黑曲霉、枯草芽孢杆菌和大肠杆菌发酵制备萝卜硫素，定性分析结果见2，定量分析结果见3。

由图2可以看出，黑曲霉和枯草芽孢杆菌均有明显的棕黑色沉淀，大肠杆菌沉淀不明显，可以确定经黑曲霉和枯草芽孢杆菌发酵后的胭脂萝卜可以产生较多的萝卜硫素。如图3所示，经黑曲霉发酵，提取的萝卜硫素更多，因此选用黑曲霉作为单因素试验的发酵菌。

图2 不同发酵菌种制备萝卜硫素的定性分析

图3 不同发酵菌种制备萝卜硫素的定量分析

2.2 单因素试验结果分析

2.2.1 发酵时间对萝卜硫素提取量的影响

由图4所示，随着发酵时间的延长，萝卜硫素提取量逐渐增大，这可能是发酵前期，培养基中的营养物质充足且均衡，黑曲霉生长比较迅速，能分泌较多的硫苷酶，其能充分降解胭脂萝卜中的硫代葡萄糖苷，将其转化为萝卜硫素。当发酵时间为96 h时，生成的萝卜硫素最多。当发酵时间在96 h后萝卜硫素提取量趋于平缓，说明此时几乎所有的硫代葡萄糖苷都已被降解，同时培养基中营养物质也变得不太均衡，抑制了黑曲霉的生长，所以萝卜硫素的提取量也将不再增长。综上分析，最适合的发酵时间在96 h左右。

图4 发酵时间对萝卜硫素提取量的影响

2.2.2 发酵温度对萝卜硫素提取量的影响

由图5所示，当发酵温度为30 ℃时，萝卜硫素提取量达到最大值。这可能是黑曲霉在发酵温度30 ℃左右时，生长较快，分泌的硫苷酶较多，能将胭脂萝卜中的硫苷转化为更多的萝卜硫素；发酵温度较低会抑制黑曲霉的生长活性，其代谢活动较弱，产生硫苷酶的量也相对较少，因此提取量较低。而发酵温度过高，一方面不利于黑曲霉的生长及代谢活动，影响硫苷酶的产生量，另一方面可能是过高的温度会影响萝卜硫素的稳定性，使其更容易分解，从而降低萝卜硫素的提取量。综上分析，最适合的发酵温度在30 ℃左右。

图5 发酵温度对萝卜硫素提取量的影响

2.2.3 液料比对萝卜硫素提取量的影响

当液料比为3∶1（mL/g）时，萝卜硫素提取量达到最大值0.501 2 mg/g（图6），其原因可能是黑曲霉生长繁殖需要水分，如果水分含量较低，会影响胭脂萝卜中营养物质的溶解性，导致黑曲霉的生长和代谢受抑制，使得萝卜硫素提取量降低；而水分过多，影响气体的传递及物料热量的散发，导致菌体氧气的利用下降，不利于菌种的生长并影响硫苷酶的活性，导致萝卜硫素提取量降低[14]。综上分析，适合的液料比为3∶1（mL/g）左右。

图6 液料比对萝卜硫素提取量的影响

2.2.4 接种量对萝卜硫素提取量的影响

由图7所示，随着接种量的增加，萝卜硫素的提取量不断增加，当接种量达到8%后，萝卜硫素的提取量却随着接种量的增大而有所降低，说明接种量过高，过多的黑曲霉会相互竞争底物的营养物质，竞争的结果反而不利于部分黑曲霉的生命活动。综上分析，考虑到生产成本，适合的接种量在8%左右。

图7 接种量对萝卜硫素提取量的影响

2.2.5 pH对萝卜硫素提取量的影响

当pH达到5.5时，萝卜硫素提取量达到最大（图8）。主要是黑曲霉的生长最适pH在5.0～6.0之间，在此环境下黑曲霉能够最大程度地进行生命活动，且分泌的硫苷酶较多，能对硫代葡萄糖苷进行有效降解，产生相对较多的萝卜硫素。同时，pH对萝卜硫素的稳定性影响较大，特别是碱性条件下会加速其分解，而在酸性和中性条件下分解较缓慢。综上分析，适合的发酵pH在5.5左右。

图8 pH对萝卜硫素提取量的影响

2.3 响应面优化试验

2.3.1 响应面试验设计与结果

以单因素试验为基础，选取对萝卜硫素提取量影响较大的四个因素（发酵温度、发酵pH、液料比、接种量）进行响应面试验，结果见表2。

表2 响应面设计安排与结果

2.3.2 回归模型的建立及方差分析

通过响应面软件进行回归分析和回归拟合，为了验证该方程是否有效以及四个发酵条件对萝卜硫素提取量的影响，因此对方程进行了方差分析，结果见表3。

以萝卜硫素提取量（Y）为响应值，运用Design Exper软件对数据进行处理，经分析得到拟合方程：Y=2.007 56+0.073 939A+0.002 285 05B+0.077 451C+0.244 02D+0.000 0219AB-0.000 367 5AC+0.000 135AD-0.000 044 25BC+0.000 021BD+0.000 562 5CD-0.001 262 7A2-0.000 043 642 5B2-0.003 335 62C2-0.022 793D2。

由表3可知，该回归方程（模型）的p＜0.01，说明回归方程极显著；而失拟项p＞0.05，不显著，说明模型拟合程度较好，且方程的决定系数为R2=0.969 8，说明响应值的变化有97%来源于所选的变量。综上分析，该模型与实际情况拟合度较好，可用作对发酵法制备萝卜硫素提取量的预测。

表3 响应面回归方程方差分析

对回归方程的各项方差的进一步分析，结果显示，因素A、B、D对萝卜硫素提取量的均具有极显著的影响，因素C对萝卜硫素提取量的影响显著，其影响大小的顺序为A＞B＞D＞C，即发酵温度＞液料比＞pH＞接种量。在分析结果中对响应值影响显著的有A、B、C、D、AB、BC、A2、B2、C2、D2。在p=0.05水平下除去不显著项，对原模型进行优化可得：Y=-2.007 56+0.073 939A+0.002 285 05B+0.077 451C+0.244 02D+0.000 021 9AB-0.000 044 25BC-0.001 262 7A2-0.000 043 642 5B2-0.003 335 62C2-0.022 793D2。

为了获得和验证响应面的最优值，并且能够直观反映出发酵温度、液料比、接种量、pH四个因素和交互作用对响应值萝卜硫素提取量的影响，运用软件作出响应面图。结果见图9和图10。

由图9可知，等高线呈椭圆形，说明AB交互显著，随着发酵温度和液料比升高，萝卜硫素提取量先升高后降低，当发酵温度一定时，随液料比的增大，萝卜硫素提取量逐渐增大到最高值，之后逐渐减少。当液料比一定时，随着发酵温度的增高，萝卜硫素的提取量增大到最高值后逐渐减少。故适当控制发酵温度和液料比可以提高萝卜硫素提取量；由图10可知，等高线呈椭圆形，说明BC交互作用显著，且液料比的等高线变化数量多于接种量的等高线变化数量，说明液料比对萝卜硫素提取量的影响大于接种量对萝卜硫素提取量的影响。

图9 发酵温度和液料比对萝卜硫素提取量的影响

图10 接种量与液料比对萝卜硫素提取量的影响

2.3.3 响应面最优值的获取及验证

结合回归方程利用软件分析，得到最大的预计值0.513 1 mg/g，最佳的发酵条件为发酵温度31.07 ℃、液料比3.11∶1（mL/g）、接种量8.31%、pH 5.69。为方便操作，将试验条件修正为发酵温度31 ℃、液料比3∶1（mL/g）、接种量8.3%、pH 5.7。在此条件下进行3次平行试验，萝卜硫素提取量均值为0.512 4±0.006 5 mg/g，与预计值相近，说明运用响应面优化试验法得到的发酵条件是可靠的。

3 结论

采用发酵法制备萝卜硫素，在单因素试验基础上，采用响应面试验对影响萝卜硫素提取量的各个因素进行优化，建立了二次多项模型，分析了发酵温度、液料比、接种量、pH之间的交互作用，验证了拟合方程的有效性。结果表明，发酵法制备萝卜硫素的最佳工艺：发酵菌黑曲霉、发酵温度31 ℃、液料比3∶1（mL/g）、接种量8.3%、发酵pH 5.7。在此工艺条件下，萝卜硫素提取量为0.512 4±0.006 5 mg/g，与模型预测值0.513 1 mg/g接近。由此说明，所建立的模型可以较好地预测各发酵条件和萝卜硫素提取量的关系，并能确定最佳的发酵条件。