基于网络药理学和分子对接探讨苓甘五味姜辛汤治疗哮喘的潜在作用机制

朱钟妍，陈 枫，王 旋

0 引言

哮喘是一种慢性炎症性疾病，以气道阻塞和支气管高反应性为特征，临床表现为反复发作的喘息、咳嗽、胸闷和呼吸急促，其病因尚未完全阐明，可能与基因和环境相互作用有关[1]。近年发表在柳叶刀的一项全国性横断面调查显示，中国哮喘的总体患病率为4.2%[2]。目前哮喘的西医治疗包括糖皮质激素、β2受体激动剂、靶向生物制剂、变应原免疫疗法等[3]。但是由于长期使用西药可能具有不良反应和耐药性，很多人也选择口服中药治疗哮喘，亦取得了较好的疗效。苓甘五味姜辛汤记载于《金匮要略》，包括茯苓、甘草、五味子、干姜、细辛五味中药，是治疗寒饮伏肺的代表方，临床上常用于治疗哮喘等肺系疾病。

网络药理学是基于系统生物学的理论，融合了计算机科学、生物信息学的新兴交叉学科，可用于分析药物与疾病和靶点之间“多成分、多靶点、多途径”的协同作用关系，在阐释中药药理机制、探究中药的毒性机制、中药新药研发等方面发挥了重要作用[4]。分子对接是从已知结构的受体及配体出发，依照几何、能量、化学环境三大互补原则，进行分子间的相互作用识别，并预测分子间的最佳结合模式，在中药有效成分潜在靶点及作用机制探索、中药复方药理机制研究等方面具有重要价值和潜在优势[5]。本研究拟通过中药复方网络药理学和分子对接的方法，探讨苓甘五味姜辛汤治疗哮喘的潜在作用机制，为进一步研究提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料 ①数据库：中药系统药理学数据库与分析平台(TCMSP，https∶//tcmspw.com/index.php)[6]、Uniprot数据库(http∶//www.uniprot.org)[7]、GeneCards数据库(https∶//www.genecards.org)、DisGeNET 数据库(https∶//www.disgenet.org)、TTD数据库(http∶//bidd.nus.edu.sg/group/cjttd)、DrugBank数据库(https∶//www.drugbank.ca)[8]、String数据库(Version 11.0，https∶//string-db.org)[9]、DAVID数据库(https∶//david.ncifcrf.gov)[10]和PDB数据库(https∶//www.rcsb.org)。②在线绘图工具：Venny(Version 2.1.0，https∶//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny)，Bioinformatics(http∶//www.bioinform atics.com.cn)。③软件：Cytoscape软件(version 3.8)、AutoDock软件(version 4.2.6)、AutoDock Tools软件(version 1.5.6)和PyMOL软件(version 2.4.0)。

1.2 苓甘五味姜辛汤成分及靶点筛选 通过TCMSP数据库分别收集茯苓、甘草、五味子、干姜、细辛的化学成分，按照ADME进行活性成分筛选，满足口服生物利用度(OB)≥30%和类药性(DL)≥0.18两个条件。同时参考2015版《中华人民共和国药典》规定的中药有效成分含量测定对其进行补充。得到各药物的活性成分后，在TCMSP数据库进行相应靶点的检索，应用Uniprot数据库对靶点名称进行规范。采用Cytoscape软件绘制苓甘五味姜辛汤活性成分-靶点网络图。

1.3 哮喘靶点筛选 以“asthma”(MeSH)为关键检索词，通过GeneCards、DisGeNET、TTD以及DrugBank数据库检索哮喘靶点。其中，Genecards数据库的“Relevance score”和DisGeNET数据库的“Score”均表示该靶点与检索疾病的关联度，若靶点过多则根据关联度的中位数进行筛选。将以上数据库得到的靶点经行合并，删除重复值后得到哮喘靶点。

1.4 共同靶点PPI网络构建及核心靶点获取 通过Venny将药物靶点与疾病靶点取交集，获得苓甘五味姜辛汤与哮喘的共同靶点，并绘制韦恩图。将得到的共同靶点导入String数据库构建PPI网络，模式选择“Multiple Protein”，物种选择“Homo sapiens”，最低相互作用值设置为“Highest confidence(0.900)”，并隐藏游离节点，其他参数不变。将得到的node1、node2、combined score导入Cytoscape软件进行可视化分析。通过该软件的Network analyzer功能进行拓扑分析，并根据degree值调整节点的大小、颜色深浅和透明度。同时采用该软件内置的cytoHubba插件对PPI网络进行MCC算法。将degree前10位靶点与MCC算法前10位靶点取交集，得到苓甘五味姜辛汤治疗哮喘的核心靶点。

1.5 GO富集及KEGG通路分析 通过DAVID数据库对苓甘五味姜辛汤与哮喘的共同靶点进行GO富集及KEGG通路分析。格式选择“OFFICIAL GENE SYMBOL”，物种及背景均选择“Homo sapiens”，分别进行细胞组分(CC)、分子功能(MF)、生物过程(BP)以及KEGG通路分析。将数据导出后按P值进行排序，每项均选取P值最小的20个采用Bioinformatics绘制高级气泡图。

1.6 “苓甘五味姜辛汤成分-哮喘靶点-通路”网络构建 将共同靶点对应的活性成分、共同靶点、前20条KEGG通路导入Cytoscape软件，构建“苓甘五味姜辛汤成分-哮喘靶点-通路”网络。通过该软件的Network analyzer功能进行拓扑分析，根据degree值筛选出苓甘五味姜辛汤治疗哮喘的核心成分。

1.7 分子对接 将筛选出的核心成分与核心靶点进行AutoDock分子对接。从TCMSP数据库下载核心成分的mol2格式文件，导入PyMOL转化为pdb格式，之后导入AutoDock Tools保存为pdbqt 格式。从PDB数据库下载核心靶点的pdb格式文件(选择分辨率<3A且具有配体的蛋白复合物)，通过PyMOL进行去水、加氢、去除原配体等处理，原子类型设定为Assign AD4 type，之后导入AutoDock Tools保存为pdbqt 格式。将蛋白复合物原配体所在的空间位置定义为活性口袋，选择Lamarckian遗传算法，运行AutoDock进行分子对接，以结合自由能为参考进行筛选，最后利用PyMOL将最佳对接结果进行可视化。

2 结果

2.1 苓甘五味姜辛汤成分及靶点获取 通过TCMSP数据库查找药物成分，根据OB≥30%和DL≥0.18进行筛选，同时参考2015版《中华人民共和国药典》，补充了甘草的成分甘草酸、五味子的成分五味子醇甲、干姜的成分6-姜辣素、细辛的成分细辛脂素。剔除无靶点成分并去除重复后，共获得114个活性成分。其中，茯苓独有成分6个、甘草独有成分86个、五味子独有成分8个、干姜独有成分4个、细辛独有成分7个、甘草和干姜共有成分1个、甘草和细辛共有成分1个、干姜和细辛共有成分1个。将114个活性成分按OB值由大到小排列，排名前20的成分见表1。通过TCMSP数据库检索，并应用Uniprot数据库对靶点名称进行规范，共搜索到茯苓靶点22个、甘草靶点228个、五味子靶点20个、干姜靶点57个、细辛靶点108个，去重后共得到苓甘五味姜辛汤靶点250个。利用Cytoscape软件绘制苓甘五味姜辛汤活性成分—靶点网络图，见图1。

表1 苓甘五味姜辛汤活性成分前20位

图1 苓甘五味姜辛汤活性成分-靶点网络图

2.2 哮喘靶点获取 通过GeneCards数据库获取哮喘靶点7 533个，由于靶点过多，将“Relevance score”由大到小排列，经过2次选取大于中位数的靶点后，得到1 957个靶点。通过DisGeNET数据库获取哮喘靶点2096个，将“Score”由大到小排列，经过2次选取大于中位数的靶点后，得到663个靶点。补充TTD数据库靶点177个、DrugBank数据库靶点103个。将4个数据库获得的靶点合并，删除重复值后，共获得哮喘靶点2 393个。

2.3 共同靶点PPI网络构建及核心靶点获取 通过Venny将苓甘五味姜辛汤靶点与哮喘靶点取交集，获得共同靶点136个，见图2。将136个共同靶点导入String数据库构建PPI网络，见图3(已隐藏13个游离节点)。将得到的node1、node2、combined score导入Cytoscape软件进行可视化分析。通过Network analyzer功能对PPI网络进行拓扑分析，节点的大小、颜色、透明度根据degree值变化，degree越大，则节点越大、颜色越深、越不透明，见图4。Degree值最小的前10位靶点依次为STAT3、JUN、TNF、AKT1、TP53、HSP90AA1、IL6、MAPK1、MAPK3、EGFR。利用内置的cytoHubba插件对PPI网络进行MCC算法分析，见图5。MCC算法得到的前10位靶点为STAT3、TNF、IL1B、IL6、CXCL8、CCL2、IL4、JUN、IL10、MAPK3。将degree前10位靶点与MCC算法前10位靶点取交集，得到苓甘五味姜辛汤治疗哮喘的核心靶点为STAT3、JUN、TNF、IL6、MAPK3。

图2 苓甘五味姜辛汤-哮喘靶点韦恩图

图3 PPI网络

图4 PPI网络拓扑分析渐变图

图5 MCC算法前10位

2.4 GO富集及KEGG通路分析 将136个共同靶点导入DAVID数据库进行GO富集及KEGG通路分析，共得到61个细胞组分(CC)、119个分子功能(MF)、606个生物过程(BP)以及126个KEGG通路。将数据导出后按P值进行排序，每项均选取P值最小的20个通过Bioinformatics绘制高级气泡图。气泡越红表明P值越小，气泡越大说明富集的基因数量越多。

GO-CC前20个富集结果为：细胞外隙、小凹、细胞质膜、胞外区、膜筏、细胞质、细胞表面、质膜组成部分、细胞外泌体、突触后膜、质膜外侧、线粒体、细胞器膜、投射神经元、细胞外基质、顶端质膜、受体复合物、突触、内质网、内质网膜。见图6。

图6 GO-CC气泡图

GO-MF前20个富集结果为：酶结合、蛋白同源二聚化活性、相同蛋白结合、药物结合、血红素结合、细胞因子活性、蛋白异源二聚化活性、G蛋白偶联乙酰胆碱受体活性、蛋白质结合、受体信号蛋白酪氨酸激酶活性、类固醇结合、蛋白磷酸酶2A结合、转录因子结合、氧化还原酶活性、辅酶Ⅱ结合、RNA聚合酶Ⅱ转录因子活性、蛋白磷酸酶结合、蛋白酶结合、NO合成酶活性调节和芳香化酶活性。见图7。

图7 GO-MF气泡图

GO-BP前20个富集结果：对药物的反应、对乙醇的反应、衰老、对缺氧的反应、对雌二醇的反应、正向调节NO生物合成过程、负向调节凋亡过程、对脂多糖的反应、正向调节基因表达、正向调节RNA聚合酶Ⅱ启动子转录、细胞对有机环状化合物的反应、脂多糖介导的信号通路、血管生成、对有毒物质的反应、正向调节血管生成、正向调节ERK1和ERK2级联、正向调节细胞增殖、正向调节DNA模板转录、炎症反应和正向调节平滑肌细胞增殖。见图8。

图8 GO-BP气泡图

KEGG前20个富集结果：乙型肝炎、癌症信号通路、TNF信号通路、南美(美洲)锥虫病、HIF-1信号通路、弓形体病、癌症中的蛋白聚糖、膀胱癌、Toll样受体信号通路、胰腺癌、利什曼病、结直肠癌、NOD样受体信号通路、FoxO信号通路、甲型流感、PI3K-Akt信号通路、前列腺癌、百日咳、疟疾和钙信号通路。见图9。TNF信号通路见图10。

图9 KEGG气泡图

图10 TNF信号通路

2.5 “苓甘五味姜辛汤成分-哮喘靶点-通路”网络构建 运用Cytoscape软件构建“苓甘五味姜辛汤成分-哮喘靶点-通路”网络，见图11。通过Network analyzer功能进行拓扑分析，根据degree值筛选出苓甘五味姜辛汤治疗哮喘的核心成分，前5位依次为檞皮素(quercetin)、山柰酚(kaempferol)、β-谷甾醇(beta-sitosterol)、7-甲氧基-2-甲基异黄酮(7-Methoxy-2-methyl isoflavone)、美迪紫檀素(Medicarpin)。

图11 “苓甘五味姜辛汤成分-哮喘靶点-通路”网络

2.6 分子对接结果 将核心成分檞皮素、山柰酚、β-谷甾醇、7-甲氧基-2-甲基异黄酮、美迪紫檀素分别与核心靶点STAT3、JUN、TNF、IL6、MAPK3进行分子对接。配体与受体的结合自由能越低，构象越稳定，表明两者的亲和力越强[11]。一般情况，结合自由能小于0则表明配体与受体可自发结合[12]。本研究分子对接得到的结合自由能均为负值，说明亲和力较好，结果见表2。其中β-谷甾醇与TNF的结合自由能最低(-13.5 kcal/mol)，应用PyMOL对其分子对接结果进行可视化，见图12。

图12 β-谷甾醇与TNF对接模式

表2 分子对接结果

3 讨论

3.1 苓甘五味姜辛汤组方分析 哮喘属中医“哮病”、“喘证”等范畴。中医学强调“痰”在哮病中的作用，认为本病发生与肺脾肾虚、宿痰内伏有关，因外感、饮食、情志、劳倦等诱因而引触[13]。“病痰饮者，当以温药和之”，故温肺化饮为哮喘的常用治法，经方可选用苓甘五味姜辛汤。方中干姜为君，入肺、脾经，既温肺化饮，又温脾化湿。细辛为方中臣药，温肺散寒化饮，助干姜温散凝聚之寒饮。茯苓健脾渗湿，既可化已聚之痰，又能杜生痰之源，亦为臣药。咳喘日久，必耗散肺气，方中诸药又是以辛散温燥之药为主，恐更伤肺气，故佐以五味子敛肺止咳，与干姜、细辛为伍，一散一收，开阖相济，散不伤正，收不留邪，既防辛散耗伤肺气，又使肺脏宣降有权。使以甘草和中，调和药性。全方配伍，共奏温肺化饮之功[14]。临床研究表明，苓甘五味姜辛汤治疗哮喘效果显著，可以更好地控制哮喘发作，改善肺功能，使临床症状好转[15]。

3.2 苓甘五味姜辛汤治疗哮喘核心成分分析 本研究通过中药复方网络药理学和分子对接的方法,初步筛选出苓甘五味姜辛汤治疗哮喘的核心成分为檞皮素、山柰酚、β-谷甾醇、7-甲氧基-2-甲基异黄酮、美迪紫檀素等。槲皮素是一种黄酮类化合物，具有抗氧化、抗炎、止咳、平喘、抗过敏等作用，可预防过敏原及血小板活化因子诱导的支气管阻塞以及支气管高反应性。动物实验表明,槲皮素保护支气管哮喘小鼠的作用与下调白细胞介素(IL)-4、IL-5等有关，对气道炎症具有抑制作用，可缓解哮喘反应[16]。山柰酚可抑制肥大细胞脱颗粒，还可以通过阻止Akt激活来降低Th2细胞因子和TNF-α水平，对细胞外调节蛋白激酶也有抑制作用，起到抑制气道上皮细胞和平滑肌细胞增生肥大的作用，有利于减轻气道狭窄[17]。β-谷甾醇具有抗炎及免疫调节作用，可抑制巨噬细胞IL-6活性，减少肿瘤坏死因子(TNF)-α等炎性因子分泌[18]。研究表明,β-谷固醇具有抗哮喘作用，可显著增加潮气量并减少呼吸频率，降低嗜酸性粒细胞和中性粒细胞水平，抑制Th2细胞因子的合成和释放[19]。美迪紫檀素等黄酮类化合物可以通过抑制Ⅳ型变态反应起到抗哮喘的作用[20]。关于7-甲氧基-2-甲基异黄酮对于哮喘的作用目前暂无研究，可能是新的发现，尚有待实验研究进一步验证。

3.3 苓甘五味姜辛汤治疗哮喘核心靶点分析 本研究根据PPI网络得到核心靶点STAT3、JUN、TNF、IL6、MAPK3。STAT3是一种细胞信号转导与转录激活因子，哮喘患者支气管黏膜组织信号传导及转录激活因子(STAT)3水平显著升高。干扰STAT3基因可减轻哮喘气道损伤，其作用机制与抑制JAK/STAT信号通路激活、炎症细胞因子的分泌、细胞内氧化应激反应有关[21]。研究表明，STAT3能有效诱导IL-6的免疫反应，可调节哮喘气道炎症，而STAT3 mRNA的表达与肺功能指标呈负相关[22]。转录激活因子AP-1是由JUN参与编码的转录因子，AP-1家族成员在激活免疫系统及控制细胞反应中起重要作用，可调节IL-4的表达，此外AP-1过度活化是哮喘糖皮质激素抵抗的机制[23]。TNF-α在哮喘患者体内存在高表达现象，TNF-α是单核巨噬细胞产生的多肽，和机体炎症、免疫反应密切相关，可激活T淋巴细胞分泌NO等介质，参与气道炎性反应和肺上皮细胞损伤过程，从而导致哮喘发生[24]。IL-6在哮喘发生发展过程中起重要作用，能活化B淋巴细胞和T淋巴细胞，在哮喘急性期调节前列腺素等炎性递质的合成与分泌，还能诱导血清中抗体水平的升高[25]。丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)参与核因子κB(NF-κB)跨膜转录活性的调节，而NF-κB信号转导通路和哮喘气道重塑关系密切[26]，此外，芯片实验与荧光定量验证结果表明，MAPK3与哮喘炎症发展密切相关[27]。

3.4 苓甘五味姜辛汤治疗哮喘信号通路分析 富集分析得到的TNF信号通路、HIF-1信号通路、Toll样受体信号通路、NOD样受体信号通路、PI3K-Akt信号通路、钙信号通路等均与哮喘关系密切，主要与气道炎症、免疫、气道平滑肌相关。JUN、TNF、IL6、MAPK3等核心靶点均位于TNF信号通路上，TNF在减轻、维持和增强炎症反应过程中起到调节作用，在哮喘发病机制中具有重要作用[28]。哮喘急性发作时，TNF-α通路激活，引起细胞中含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)-8和Caspase-3水平升高，使细胞凋亡发生，最终诱发哮喘[29]。特异性阻断TNF-α的药物可延缓疾病进程，控制并缓解炎症[30]。缺氧诱导因子(HIF)是适应缺氧的关键介质，可增强各种靶基因的转录，通过调节代谢来降低氧依赖性途径[31]。研究表明，HIF-1α可与下游靶蛋白血管内皮生长因子(VEGF)协同作用，促使嗜酸粒细胞等炎症细胞浸润，并参与气道重塑，在哮喘的发生中具有重要作用[32]。Toll样受体对于哮喘具有双重作用，能加剧或改善气道炎症反应，Toll样受体信号可以通过干扰B细胞的免疫球蛋白同种型转换或通过干扰参与过敏性炎症的细胞，从而影响早发型哮喘反应和晚发型哮喘反应[33]。体内及体外试验表明，NOD1和NOD2介导的免疫机制是通过调节人体嗜酸性粒细胞和支气管上皮细胞的相互作用，调节表面黏附分子及细胞内IL-4Ra表达，刺激过敏性哮喘趋化因子和细胞因子释放[34]。PI3K-Akt信号通路在支气管哮喘中起着重要作用，特异性PI3K抑制剂可以显著下调小鼠肺组织Akt的磷酸化，抑制Th2细胞因子产生、嗜酸性粒细胞浸润、黏液产生以及气道高反应性。可逆性气道阻塞是哮喘的重要特征，其主要机制是气道平滑肌的功能异常，而钙信号是调节气道平滑肌细胞功能的重要机制，钙通道在哮喘气道高反应性和气道重塑中具有重要作用[35]。

4 小结

本研究通过网络药理学的方法，初步发现苓甘五味姜辛汤中的檞皮素、山柰酚、β-谷甾醇、7-甲氧基-2-甲基异黄酮、美迪紫檀素等成分，可能通过TNF信号通路、HIF-1信号通路、Toll样受体信号通路、NOD样受体信号通路、PI3K-Akt信号通路、钙信号通路等多种途径，作用于STAT3、JUN、TNF、IL6、MAPK3等哮喘靶点，从而发挥缓解气道炎症、调节免疫和气道平滑肌等作用。本研究通过AutoDock分子对接对研究结果进行验证，对接结果的结合自由能均为负，靶蛋白与配体分子的亲和力较强。综上所述，本研究通过网络药理学和分子对接的方法，初步探讨了苓甘五味姜辛汤治疗哮喘的潜在作用机制，为进一步实验研究提供了理论基础和依据。