西鄂尔多斯自然保护区沙冬青根际土壤细菌的分离培养研究

范明浩 内蒙古自治区林业和草原工作总站

沙冬青又称蒙古黄花木、冬青、蒙古沙冬青，是生长在亚洲中部地区的超旱生常绿豆科灌木，在我国多分布于内蒙古、甘肃、宁夏等海拔1000～1200米的低山地带。沙冬青是古老的第三纪残遗种，也是荒漠地域稀有的孑遗植物，是国家二级保护植物。沙冬青具有很强的耐寒、耐旱、耐高温、抗逆和耐贫瘠等特性，是荒漠地区理想的防风固沙造林树种。

沙冬青的研究受到国内外生态学、地理学、生理学、生物学、遗传学等学科研究学者的普遍关注。关于沙冬青的科学研究对揭示其濒危机制、制定科学合理的保护措施和有效的开发利用对策具有重要的科学价值和现实意义。目前，关于沙冬青土壤微生物的研究较少。由于其自然生长条件恶劣，且多年来遭受过度采伐，沙冬青分布面积逐年减少，并出现了分布破碎化的情况，急需采取措施减缓其衰退趋势。土壤细菌是荒漠土壤微生物系统的重要成分，是沙生植物根际微生物的重要组成之一，研究土壤细菌对沙冬青的保护具有重要意义。

为了探究沙冬青的土壤细菌群落，本研究采集了沙冬青的根际土壤，并通过梯度稀释涂布对细菌进行分离、培养、菌种的纯化及革兰氏染色，并对菌落的形态进行描述。本研究共获得13 个菌种，菌种的菌落形态差异特征明显，且以放线菌群为主，可为今后沙冬青的保护提供微生物资源。

一、实验地自然概况

西鄂尔多斯国家级自然保护区是研究我国西北地区生物多样性的重点区域，是一个以保护古老孑遗濒危植物、草原向荒漠过渡的植被带和多样的生态系统为主要目的的综合性自然保护区。该区地处鄂尔多斯高原西缘至黄河东岸，地理范围大致以贺兰山—阿尔巴斯山—狼山构成的三角核心区为中心，总面积4719.89 平方公里（包括乌海辖区168.98 平方公里），其中，核心区面积1113.12 平方公里，缓冲区面积534.79 平方公里，实验区面积2903 平方公里。海拔1000～2100 米；无霜期129 天，年平均降水量272.3 毫米，年平均蒸发量2470.4 毫米，年平均风速3.2 米/秒，最大风速24.2 米/秒。保护区内现已查明的野生维管植物共有64 科215 属433 种。其中，沙冬青、四合木、半日花是在西鄂尔多斯国家级自然保护区生长的古地中海孑遗植物，研究价值极大。

二、材料与方法

1.样品采集

2019年7月，笔者在西鄂尔多斯国家级自然保护区沙冬青分布比较集中的区域选择3 个样地，每个样地相距1～2 公里。采集沙冬青根际土壤，装入塑料袋中，并进行编号。样地1 采集样品19 份，样地2 采集样品11 份，样地3 采集样品13 份。将采集的根际土壤当天带回内蒙古自治区林业和草原工作总站实验室，放置于冰箱内4℃条件下保存，并在一周内进行分离实验。

2.菌种的分离培养

从实验样地共取到43 个土样，对每个土样菌种进行分离培养。本实验采用梯度稀释涂布和平板划线的方法进行细菌分离，培养基为0.5 克琥珀酸钠、0.4 克磷酸二氢钾、0.1 克氯化钠、0.002 克钼酸钠晶体、0.2 克氯化钙、0.1 克磷酸氢二钾、0.1 克氯化铁、5 毫升BTB 溶液（5 克/升）和0.2 克七水硫酸镁，加蒸馏水定容至1 升，加 8～16 克无氮琼脂。

具体步骤：（1）取部分土样研磨成粉末状，置于10 毫升的生理盐水中用摇床震荡30 分钟，培养温度为37℃，静置使之澄清。（2）取上清液用无菌水稀释为10-1、10-2和10-3三个梯度。（3）将稀释液置于80℃水中，10 分钟后立即取出。（4）吸取200微升各个浓度稀释液涂平板于LB固体培养基中，每个梯度3 个重复，37℃培养18 小时。（5）挑取培养皿中的单菌落置于新的LB 培养基中，培养条件同步骤四。（6）仔细观察后挑取形态大小不同的单菌落置于20 毫升液体LB 培养基中，37℃震荡培养18 小时，采用平板划线分离法纯化，一直到获得纯培养为止。

对43 个土样都进行上述细菌分离培养，经过一周的培养，每个培养皿中都长了许多不同形态的菌落，从中挑取长势良好的菌落进行下一步纯化培养。

3.菌种的纯化

经过分离培养后，挑取长势良好的细菌进行纯化培养，得到13 个菌种，在超净工作台对这13 个菌种进行二次纯化培养，纯化培养基和分离培养基相同，同时观察菌落的形态特征并记录。

4.革兰氏染色

革兰氏染色步骤参照微生物学的方法。

三、结果

1.菌种纯化结果

经过一周的培养获得13 个菌种，不同菌种的菌落形态见表1，大致分为三类。第一类菌落都呈现出圆形或近圆形的白色匍匐状的菌丝，中央伴有黑色的点状小突起，在电子显微镜下可以观察到菌丝和孢子（图1）；第二类菌落为近圆形，白色，中间有黄色的脓状物，在显微镜下可以观察到菌丝和孢子（图2）；第三类菌落呈现黄色的脓状物，圆形，较小，有色泽，较光滑，并且易调取（图3）。

表1 不同菌种的菌落形态

图1 第一类菌种菌落特征

图2 第二类菌种菌落特征

图3 第三类菌种菌落特征

2.革兰氏染色结果

经过革兰氏染色后，编号为1～11 的菌种，可以看到蓝紫色的菌丝和孢子，可确定为放线菌，如图4。编号为12 的菌种可以观察到蓝色的菌丝、孢子，也为放线菌，如图5。编号为13 的菌种，为革兰氏阴性细菌，如图6。

图4 1～11 号菌种染色后的形态

图5 12 号菌种染色后的形态

图6 13 号菌种染色后的形态

四、讨论

沙冬青生长的沙地环境十分特殊，特殊生境的土壤微生物资源具有很强的适应性。在沙冬青保护地的土壤中分离鉴定土壤细菌、深入探究其多样性具有极其重要的意义和巨大的应用潜力。

本研究从43 个沙冬青根际土样中分离纯化共获得13 个菌种，菌落形态有明显差异，总体上可分为三大类，分别是圆形或近圆形的白色匍匐状的菌丝，中央伴有黑色的点状小突起；近圆形，白色，中间有黄色的脓状物；呈现黄色的脓状物，圆形，较小，有色泽，较光滑。

革兰氏染色的结果表明分离获得的菌种以放线菌为主，这可能与放线菌更适合在本研究采用的培养基中生长有关。王文晓等运用高通量测序技术揭示了蒙古沙冬青根际土壤细菌群落，隶属于15 门43纲68 目123 科185 属；主要优势细菌群为蓝菌门占65.74%、变形菌门占21.72%、放线菌门占6.28%；优势菌纲为α-变形菌纲、放线菌纲和γ-变形菌纲。与高通量测序的结果相比较，本研究获得的菌种非常少，主要是因为很多微生物不容易被分离培养，并且与采样时间、采样地点、沙冬青的生长状况以及气象和土壤因子都有关系。尽管数量有限，但这些菌种可以通过后期与沙冬青进行回接，探究不同菌种对沙冬青生长的影响，对沙冬青的原地保护具有借鉴意义。