COL6A1基因嵌合突变的Bethlem肌病一例并文献复习

吴若豪 邱坤银 唐文婷 何展文

【摘要】目的 報道1例由COL6A1基因嵌合突变所致的Bethlem肌病，并分析该突变的致病性。方法 应用全外显子基因组测序法（trio-WES）对1例Bethlem肌病患儿及其父母进行基因测序，对检出突变进行生物信息学预测，并以“Bethlem肌病”“COL6A1”（包括中英文）为检索词在PubMed、CNKI、中华医学期刊全文数据库（MedBook）检索相关病例，在千人基因组数据库、ExAC数据库及ClinVar数据库检索患儿的基因突变。结果 经trio-WES检测发现，患儿COL6A1基因第8外显子存在1个c.868G > A （p.G290R）错义突变（突变频率为48.13%），该突变同时在其父亲外周血中检出，但突变频率仅7.89%，考虑为嵌合突变（突变频率<10%），属于新发突变（PS2）;该突变导致的蛋白水平改变发生在甘氨酸位置，属于COL6A1基因热点区域突变（PM1）;同时该突变在正常人群突变频率数据库中均不存在（PM2）。经多种有害突变预测软件预测结果均提示c.868G > A （p.G290R）为有害突变（PP2+PP3），根据美国医学遗传学与基因组学学会指南判定该新发错义突变为致病性突变（PS2+PM1+PM2+PP2+PP3）。在数据库检索到6例COL6A1基因突变所致Bethlem肌病先证者，无存在嵌合突变者。结论 COL6A1基因c.868G >

A （p.G290R）为该患儿罹患Bethlem肌病的致病原因，该突变未曾被报道，这在一定程度上扩充了COL6A1基因的变异谱。

【关键词】COL6A1基因;Bethlem肌病;嵌合突变;错义突变

Identification of a novel chimeric mutation in the COL6A1 gene of a child with Bethlem myopathy： a case report and literature review Wu Ruohao， Qiu Kunyin， Tang Wenting， He Zhanwen. Department of Pediatrics， Sun Yat-sen Memorial Hospital， Sun Yat-sen University， Guangzhou 510120，China

Corresponding author， He Zhanwen， E-mail：  hezhanw@mail.sysu.edu.cn

【Abstract】Objective To report one case of Bethlem myopathy caused by COL6A1 chimeric mutation and analyze the pathogenicity. Methods Trio-Whole Exome Sequencing （trio-WES） was conducted to detect the putative pathogenic mutations of the boy diagnosed with Bethlem myopathy and his parents. The impact of the detected mutations was predicted and validated by bioinformatics. Relevant cases were searched from PubMed， CNKI and MedBook databases using “Bethlem myopathy” and “COL6A1” as the keywords. The gene mutations of the affected child were searched from the mutation frequency databases of healthy population. Results A missense mutation of c.868G > A （p.G290R） in the exon 8 of COL6A1 gene was identified in the child and his father by trio-WES. However， the frequency of this mutation in his father was only 7.89%（<10%）， which was considered as chimeric mutation （de novo mutation） （PS2）. This mutation was glycine-related mutation， which was considered as hotspot variation in the COL6A1 gene （PM1）. However， this mutation was absent in major allele frequency databases （PM2）. The results of multiple pathogenic variant prediction software prompt that c.868G > A （p.G290R） is a pathogenic mutation （PP2+PP3）. According to the American College of Medical Genetics and Genomics （ACMG） variant classification guidelines， the variant of c.868G > A （p.G290R） in the COL6A1 gene in this child was classified as pathogenic mutation （PS2+PM1+PM2+PP2+PP3）. After literature review， six probands of Bethlem myopathy with COL6A1 variant were searched. However， Bethlem myopathy with COL6A1 chimeric variant has not been reported. Conclusion The chimeric mutation of c.868G > A （p.G290R） in the COL6A1 gene is the pathogenesis of Bethlem myopathy， which has not been reported. This case report expands the variation spectrum of COL6A1 gene.

【Key words】COL6A1 gene;  Bethlem myopathy;  Chimeric mutation;Missense mutation

Bethlem肌病（BM）是一种常染色体显性遗传性肌病，由COL6A1基因变异所致。2011年，Bönnemann[1]阐明该先天性疾病的临床表现主要为近端肌无力、长手指屈肌、手肘及脚踝等关节挛缩。该病发病年龄不定，产前期可仅表现为胎儿运动减少;新生儿期可出现四肢肌张力减弱或斜颈;婴幼儿期可出现运动发育迟滞、肌无力及关节挛缩;成年期多有较为明显的近端肌无力及跟腱、长指屈肌挛缩。该病病程进展多较缓慢，但随着时间推移，患者可逐步表现出起立困难及行走失控等丧失自理行为的症状。此外，Bönnemann[1] 还阐明了COL6A1基因为BM发病的致病基因，其遗传模式为常染色体显性遗传，呈散发、非家族聚集性发病。BM是一种罕见先天性肌病，但随着基因测序技术的发展，越来越多BM患者被确诊，尽管如此，笔者却发现突变类型为嵌合突变者鲜有报道。由于不同突变类型的BM患者在临床表型上可能存在不同，因此报道罕见突变类型就提高国内医师对BM的认识具有一定价值。本研究拟对1例通过临床表型及基因诊断确诊的存在COL6A1基因嵌合突变的BM男性患儿进行突变致病性及临床表型的分析，并检索国内外相关文献及基因数据库进行归纳总结[2]。

对象与方法

一、1例COL6A1基因嵌合突變的BM患儿临床资料的收集

收集于2019年1月在中山大学孙逸仙纪念医院就诊的1例COL6A1基因嵌合突变的BM患儿的临床资料，本研究已获该院伦理委员会批准（批件号：SYSEC-KY-KS-2021-261）。

二、基因分析

1. 外周血染色体微阵列分析

抽取患儿静脉血2 mL经CytoScan HD芯片（270万拷贝数分析标记，包含195万拷贝数探针，75万SNP探针）检测，按照Affymetrix CytoScan HD SNP Array微阵列芯片的标准操作流程进行操作和结果分析，并与OMIM、 DGV及DECIPHER等数据库进行比对。

2.外周血染色体核型分析

抽取患儿静脉血2 mL进行常规染色体G显带检查，分析20个分裂相。

3.目标序列捕获及高通量基因测序

抽取患儿及其双亲静脉血各2 mL置于抗凝管中，经基因组DNA提取试剂盒提取全基因组DNA。用超声震断仪打断DNA获取长度在200～300 bp的DNA片段;构建测序文本库，在Illumina MiSeq高通量测序平台对靶基因序列进行捕获，该测序panel覆盖包括COL6A1基因在内的4000多种单基因遗传病相关基因的全部外显子及外显子内含子交界区。

4.测序数据分析及筛选

对测序数据进行处理，过滤掉低质量（质量≥20）和低覆盖度（深度≥10）SNP，应用CCDS、HGNC、dbSNP数据库信息对过滤后SNP进行注释，确定候选突变位点，排除人群频率 > 1%的突变位点，结合患儿临床表型确定疑似致病突变位点，同时在千人基因组数据库、ExAC数据库及ClinVar数据库中进行比对，以进一步排除基因多态性[3]。

5.生物信息学分析

测序结果得到的碱基突变按den Dunnen and Antonarakis法则进行命名[4]。利用PolyPhen-2、Mutationtaster及PROVEAN软件对突变进行功能预测;HomoloGene系统分析新发突变的氨基酸位点是否具有跨种属保守性;BLAST系统分析突变影响的蛋白结构域。

三、文献检索

以“Bethlem肌病”（中英文）及“COL6A1”为检索词，对PubMed、CNKI、中华医学期刊全文数据库（MedBook）截至2021年10月收录的论文进行检索，收集并归纳总结具有完整先证者基因型及临床表型描述的COL6A1突变所致BM病例。

结 果

一、1例COL6A1基因嵌合突变的BM患儿临床资料

患儿男，6岁，因四肢肌无力伴蹲下后起立困难3年余于2019年1月在中山大学孙逸仙纪念医院就诊。患儿足月顺产娩出，其母亲系孕1产1，

孕产史无特殊，其父母临床表型均正常，否认近亲婚配。家庭成员中无类似遗传病病史可循。患儿生后四肢肌张力低，活动少，自幼运动发育均较同龄儿落后，四肢肌肉松弛，以近端肌肉明显。3岁开始出现下蹲后起立困难，症状随年龄增大而加重，现可独立行走，但行走时间不长，上楼梯费力明显，需双手扶膝休息。曾多次于当地医院就诊，予规律康复治疗2年余上述症状未见明显缓解。体格检查：四肢肌力、肌张力均偏低，以近端肌群明显，Gower征阳性，且存在脊柱强直，见图1A、B;双手腕关节、掌指关节出现挛缩、活动受限;右侧膝关节皮肤存在瘢痕结节，见图1C、D。实验室检查：外周血磷酸肌酸激酶121 U/L（正常）;CK-MB 28 U/L（稍高）;外周血肌红蛋白21 μg/L

（明显降低）;其余实验室检查包括血尿粪常规、内分泌激素及免疫学相关检查等均未见异常。头颅MRI、心脏彩色多普勒超声检查（彩超）及腹部B超等影像学检查均未见明显异常。患儿临床表型符合先天性肌病可能，为明确诊断，抽取患儿及其父母外周血进行全外显子基因组测序检查，患儿父母表示同意并签署知情同意书。经基因检测后明确BM诊断，立即予患儿规律康复治疗配合营养肌肉鸡尾酒疗法（维生素B1 500 mg/d，硫辛酸 600 mg/d，左卡尼汀 2000 mg/d，维生素E

300 mg/d，维生素C 500 mg/d，辅酶Q10 90 mg/d）治疗，同时嘱咐家属予其低碳水化合物饮食，加强补充中长链脂肪酸，并保证充足蛋白质供给，定期随访复查。经上述规律治疗1年半后患儿来我科复查，结果显示四肢肌无力症状较前改善，四肢肌力、肌张力均较前提高，独立行走时间较前增加，尽管上楼梯仍明显费力，但扶膝休息次数明显减少;双手腕、掌指关节挛缩及右膝关节瘢痕结节仍持续存在。复查外周血磷酸肌酸激酶水平正常，为90 U/L;CK-MB恢复至正常水平，为19 U/L;外周血肌红蛋白较前变化不大，仍为21 μg/L。

二、基因分析

1.基因变异检测结果

患儿外周血染色体核型及染色体微阵列分析均无异常，而全外显子基因组测序检出患儿COL6A1基因第8外显子存在c.868G > A （p.G290R）错义突变（突变频率48.13%）。该突变同时在其父亲中有检出，但突变频率仅7.89%，小于10%，考虑为嵌合突变，可判定该突变在该家系为新发突变（de novo，PS2），见图2。c.868G > A导致编码的胶原蛋白Ⅵα1链第290位天冬甘氨酸（Gly， G）替换为精氨酸（Arg， R）。这一发生在甘氨酸（Gly）位置的错义突变在COL6A1基因相关疾病的致病突变中占70%以上，属于热点变异区域（PM1）[4]。同时该突变在千人基因组数据库、EXAC及ClinVar等数据库均无收录（PM2），属于国内外未经报道的新发突变。

2.生物信息学分析结果

Jöbsis等[5]阐明了COL6A1基因上较少存在良性突变，COL6A1基因上的新发错义突变是造成BM的主要原因（PP2）。该基因第8外显子c.868G > A突变导致其编码蛋白第290位氨基酸替换，应用不同突变预测软件对该突变进行有害性突变预测：其中PROVEN预测结果显示为“deleterious （-5.502）”;MutationTaster预测结果显示为“disease-causing （0.999）”;PolyPhen-2預测结果显示为“probably damaging （HumDiv：1.000， HumVar：1.000）”，见图3A。经HomoloGene系统对人类、黑猩猩、犬、牛、鼠、鸡、蟾蜍及斑马鱼的胶原蛋白Ⅵα1链保守性分析发现该酶第290位G在无脊椎动物至脊椎动物乃至哺乳动物之间均高度保守，见图3B，提示该位置上的氨基酸改变可能对编码蛋白结构及功能有一定影响;进一步通过PubMed BLAST系统分析发现，该突变所致290位G替换为R可导致编码蛋白中胶原蛋白超家族成员的重要二级结构单元Glycine-X-Y三联体完整性发生改变，蛋白活性丧失（PP3），见图3C。综上所述，根据 2015年美国医学遗传学与基因组学学会（ACMG）序列变异解释指南，COL6A1基因c.868G > A （p.G290R）被判定为致病性突变（PS2+PM1+PM2+PP2+PP3），可导致本例患儿罹患BM[6]。

三、文献检索结果

在国内数据库共检索到2例具有完整基因型及临床表型描述的COL6A1突变所致BM的先证者[7-8]。而在国外数据库共检索到4例有完整基因型及临床表型描述的COL6A1突变所致BM的先证者，其中存在嵌合突变者数量为0[9-12]。6例先证者临床表型及基因型特点见表1。

讨 论

COL6A1基因编码的胶原蛋白Ⅵα1链是一种在维持细胞外基质结构和功能方面起着重要作用的细胞黏连蛋白亚链成分。胶原蛋白Ⅵ在人体多种组织如肌肉、皮肤以及软骨中均明显表达，可通过形成微纤维网络结构来维持细胞外基质的结构和功能。胶原蛋白Ⅵ由不同的肽链（α1、α2和α3）组成，这3类肽链分别由COL6A1 、COL6A2 和COL6A3编码合成。胶原蛋白Ⅵ为四聚体，共由12个亚基组成，其中10个亚基由α3肽链组成，而剩余2个亚基则分别由α1和α2肽链组成，因此当COL6A1基因发生突变时，其编码的α1肽链结构完整性会被破坏，使得胶原蛋白Ⅵ亚基间无法正常连接形成单体，进而无法形成四聚体结构，最终导致胶原蛋白微纤维网络形成障碍，细胞外基质结构和功能受损。COL6A1基因变异导致的相关疾病包括BM和Ullrich型先天性肌营养不良（UCMD）。Bertini等[13]认为与BM遗传模式为常染色体显性遗传不同，UCMD呈常染色体隐性遗传，虽然两者临床表现相似，均以近端肌无力合并关节挛缩为主要临床特征，但UCMD临床表型相对更重，且起病更早（多于出生前或出生后不久起病），预后也相对更差。本例患儿幼儿期起病，起病时间相对较晚，虽存在四肢近端肌无力和远端关节挛缩，且肌酶轻度升高，但不存在呼吸肌麻痹等严重影响寿命预后的症状;结合患儿的遗传特点及检出的COL6A1基因突变致病等级，支持BM的诊断。

本例患儿检出的突变c.868G > A （p.G290R）位于COL6A1基因第8外显子，此突变可导致位于α1肽链N末端的重要的三螺旋结构域（Glycine-X-Y三联体）中第290位的Gly被Arg所取代。Butterfield等[14]阐明由于α1、α2及α3肽链间均需通过Glycine-X-Y三联体结构来相互连接形成单体，因此发生在Glycine-X-Y三联体Gly位点的突变对胶原蛋白Ⅵ结构影响非常大，通常与较严重的BM表型有关。本例患儿除存在四肢肌无力及蹲下后起立困难外，还存在脊柱强直、关节挛缩以及瘢痕结节等症状，符合重型BM的临床表型。另一方面，本例患儿父亲亦检出该COL6A1基因突变，但并无相应的症状体征，出现基因型与临床表型不一致的原因主要有2点：一种可能即该突变在患儿父亲身上发生外显不全，因而无临床表现;另一种可能为其父亲检出的突变属于嵌合突变，即体细胞基因无该突变，只是生殖腺基因发生了该突变，故而无临床症状。通过进一步检测父亲这一突变的发生频率可发现嵌合突变可解释本例患儿父亲出现的情况，因此对于遗传学分析中发现类似基因型与临床表型不一致的情况，应进一步分析突变频率作甄别与判断。

综上所述，本文报道了1例具有典型重型BM临床特点的病例，通过分子生物学分析，不仅发现了1个未曾被报道的COL6A1致病突变，扩增了BM的基因变异谱，同时还发现了本例患儿COL6A1新发突变（de novo）来源于其父亲生殖腺发生的突变，为该家系进行准确的遗传咨询提供了可能。

参 考 文 献

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（收稿日期：2021-06-16）

（本文编辑：洪悦民）