龙葵总碱对人骨髓瘤RPMI8226荷瘤裸鼠的抑瘤作用*

刘 凯，王 跃，聂 甜，郝敬全，黄 蓉，江劲波

湖南中医药大学第一附属医院，湖南 长沙410208

多发性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）是一种恶性浆细胞肿瘤，占血液肿瘤的10%～15%，死亡率占血液系统恶性疾病的1/5，属于病死率较高的难治性血液恶性肿瘤［1］。西医采用以硼替唑米（bortezomib，BTZ）、来那度胺为基础的诱导/巩固化疗方案能最大程度降低肿瘤负荷，但复发率高［2］，副作用较大［3］。近年来，本课题组在中医辨证中加入龙葵用于骨髓瘤各证型的治疗。龙葵总碱是龙葵中的活性生物碱。前期研究通过体外实验方法证实了其具有诱导人多发性骨髓瘤细胞系RPMI8226凋亡的作用［4］。本研究通过体内实验检测龙葵总碱对荷瘤小鼠骨髓瘤细胞的抑制作用，进一步探究龙葵总碱抗骨髓瘤的相关机制，为开发新型抗骨髓瘤药物提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物与细胞株4周龄SPF级BALB/c裸鼠90只，体质量15～20 g，均为雌鼠，购自上海宝特生命科学发展有限公司［SYXK（湘）2013-0005］。RPMI-8226骨髓瘤细胞株（武汉兴旺生物科技有限公司，批号：5078）。

1.2 主要药物与试剂硼替佐米注射剂（西安杨森制药有限公司，批号：160823591，规格：1.0 mg）；龙葵总碱（芜湖甙尔塔医药科技有限公司）；RPMI1640培养基（Gibco公司，批号：YXQ-511）；胎牛血清（Gibco公司，批号：SH30070）。

1.3 仪器与设备DYY-6C型电泳仪和WD-9405B型水平摇床（北京六一仪器厂）；THZ-82A型恒温摇床（金坛荣华仪器制造有限公司）；MERCK MILLIPORE D24型紫外线超纯水表（苏州赛恩斯仪器有限公司）；台式高速冷冻离心机（美国Thermo公司）；生物净化工作台（美国AIRTECH公司）；细胞培养箱（香港HEAL FORCE公司）；万分之一电子天平（上海Ohaus公司）；HT-7800型透射电子显微镜（日本日立公司）。

1.4 实验方法

1.4.1 细胞培养将RPMI-8226骨髓瘤细胞株加入含10%胎牛血清，加双抗（青霉素100 U/mL，链霉素100 mg/L）RPMI 1640培养液内，置于37℃、50% CO2饱和湿度培养箱中培养。取对数生长期RPMI-8226骨髓瘤细胞，台盼蓝染色拒染率95%以上，用无血清RPMI1640培养基洗涤2次后悬于1∶1混匀无血清RPMI 1640培养基中，调整细胞密度为2×106/mL，收集细胞前一晚更换新鲜培养基。

1.4.2 荷瘤裸鼠模型的建立与分组

1.4.2.1 建模除空白组外，其余各组裸鼠均采用刘瑜法［5］建立骨髓瘤移植小鼠模型，即SPF环境下在每只裸鼠右前肢外侧皮下接种细胞悬液2×106/0.2 mL。造模成功标准：随机取1只模型小鼠处死，取其瘤组织进行病理检测，包括HE染色和免疫组织化学染色、血清免疫固定电泳。HE染色后可见大量原始、幼稚浆细胞聚集分布，免疫组织化学染色后可见浆细胞CD38（+）或κ、λ轻链（+），血清免疫固定电泳检测到M蛋白。

1.4.2.2 分组将造模成功裸鼠随机分成5组各15只。空白组与模型组灌胃生理盐水10 mL/（kg·d），硼替佐米组皮下注射硼替佐米0.1 mg/（kg·d），龙葵总碱高、中、低剂量组分别灌胃龙葵总碱50、25、12.5 mg/（kg·d）。每日2次，每次0.1 mL，连续灌胃14天。

1.5 指标检测

1.5.1 肿瘤组织观察用15%的中性福尔马林溶液固定肿瘤组织，梯度乙醇脱水、石蜡包埋、切片（5 μm厚），按顺序依次记录各样品对应包埋块编号，用苏木精-伊红（HE）染色后观察薄膜，放大倍数为400；眼眶静脉丛取血行免疫固定电泳及免疫分型检测。

1.5.2 龙葵总碱体内抑瘤作用最后1次灌胃后绝对禁食6 h，第2日断颈处死裸鼠，解剖荷瘤裸鼠取肿瘤称质量，根据瘤质量计算抑瘤率：

抑瘤率(%)=（模型对照组平均瘤重-治疗组平均瘤重)/模型对照组平均瘤重×100%

另将瘤块组织切小块（按照实验动物编号顺序排列），液氮速冻，-80度保存。隔日测定瘤体积，肿瘤体积（mm3）=（a2×b）/2，公式中a为肿瘤宽度（mm）；b为肿瘤长度（mm）。

1.5.3 细胞形态观察取出样本用磷酸盐冲洗液（PBS）清洗3次，10 min/次，静置60 min，1%锇酸后固定液固定1 h，PBS清洗3次，10 min/次；用50%～100%酒精逐级脱水，37℃条件下嵌入环氧树脂Epon812和丙酮混合物（1∶1）浸泡和包埋1 h，包埋剂与丙酮混合液（3∶1）浸透，过夜；纯包埋剂浸透24 h，然后进行包埋，在60℃条件下聚合48 h。Leica EM UC7超薄切片机切片，日立HT-7800透射电镜观察。

1.6 统计学方法采用SPSS 24.0软件分析数据，计量资料以±s表示，两组间比较采用t检验，并且使用ANOVA模块进行多组间比较。

2 结果

2.1 骨髓瘤小鼠模型建立接种人骨髓瘤细胞第5天后种植部位即可触及新生组织，接种第10天后全部小鼠皮下开始出现肿块，解剖出肿瘤组织行石蜡切片染色及血清免疫蛋白电泳、流式分型检测，证实所取组织确为多发性骨髓瘤组织。见图1—4。

图1 成瘤裸鼠

图2 瘤组织石蜡切片（HE×400）

图3 免疫蛋白电泳结果κ轻链（+）

图4 流式细胞表达CD38（+）与cKappa

2.2 龙葵总碱对荷瘤裸鼠瘤体积和瘤重的影响与模型组对比，龙葵总碱灌胃或硼替佐米注射荷瘤裸鼠，结果显示龙葵总碱对裸鼠皮下移植瘤生长具有抑制作用。龙葵总碱低、中、高剂量组和硼替佐米组的瘤重及瘤体积较模型组减轻、变小，差异均有统计学意义（P＜0.05）；龙葵总碱中、高剂量组的抑瘤率分别为42.4%和53.8%，均高于低剂量组的19.2%（P＜0.01）。见表1。

表1 各组移植瘤瘤重、瘤体积和抑瘤率的比较

2.3 龙葵总碱对荷瘤裸鼠肿瘤细胞的影响模型组肿瘤细胞中存在大量原浆和幼浆细胞，肿瘤细胞体积大，细胞核呈蓝紫色，细胞核大，染色质浓缩在核膜下，深染并浓缩成块状，典型的有丝分裂细胞明显。龙葵总碱高、中、低剂量组均出现不同程度的细胞破碎和凋亡，细胞排列呈不同程度的疏松状，可见大片细胞坏死，而硼替佐米组细胞形态呈破碎状，原浆和幼浆细胞明显减少，细胞染色质明显疏松。见图5。

图5 各组荷瘤裸鼠肿瘤组织细胞形态（×400）

2.4龙葵总碱对荷瘤裸鼠超微结构的影响模型组瘤细胞外形多数规则，细胞核多呈圆形或椭圆形，核内常染色质占优势，核仁明显而大，胞浆多少不定，并出现自噬小体，细胞粗面内质网极丰富。部分板层状排列，且有不同程度的扩张，电子密度高低不等，线粒体及包涵体多少不一（图6A）；龙葵总碱低剂量组瘤细胞出现皱缩，细胞质出现浓缩，电子密度中度，线粒体数量减少，核内异染色质在周边及异质中部分凝集成块（图6B）；龙葵总碱中剂量组瘤细胞体积进一步缩小，细胞染色质固缩，核边集，细胞浆浓缩，内质网疏松形成空泡，并开始出现自噬细胞（图6C黑色箭头所指）。龙葵总碱高剂量组细胞呈晚期凋亡形态，已无完整的细胞膜，骨髓瘤细胞周围出现大量的自噬细胞（图6D）。

图6 TEM下各组瘤细胞超微结构（×10000）

3 讨论

龙葵味苦、微甘，《药性论》载其有清热解毒、活血散瘀之功，龙葵总碱是龙葵中分离出来的甾体生物碱［6］，广泛存在于马铃薯、番茄及茄子等茄科植物组织和器官中。AKSHATHA等［7］通过动物实验研究发现，龙葵碱具有诱导肝细胞癌的凋亡作用。另有研究证明，对胃癌［8］、白血病［9］等具有广泛抗肿瘤活性。刘新民等［10］研究表明：龙葵碱能够改变肿瘤细胞ATP酶的活性、阻断NF-κB信号通路的介导等诸多媒介来改变细胞膜结构与作用，最终实现抗瘤目的。顾锦华等［11］观察复方龙葵胶囊对荷瘤小鼠的作用，结果显示实验药物可促进S180肉瘤细胞凋亡。但目前国内外对龙葵总碱在诱导多发性骨髓瘤凋亡方面的报道相对较少。本课题组将龙葵广泛用于浆细胞骨髓瘤的各阶段治疗，结果表明能减少MM患者的肿瘤负荷，降低血清M蛋白含量，提高抗骨髓瘤疗效［12］。通过体外实验证明龙葵总碱可以抑制骨髓瘤RPMI-8226细胞NF-κB表达，呈药物浓度与时间依赖性，促骨髓瘤细胞凋亡作用明显［4］。

本研究结果显示龙葵总碱对荷瘤裸鼠的骨髓瘤细胞具有明显抑制作用，呈剂量依赖性。近年来，随着细胞遗传学与分子遗传学的不断深入，临床将诱导肿瘤细胞凋亡视为骨髓瘤治疗有效的重要途径。在观察龙葵总碱对骨髓瘤荷瘤小鼠细胞凋亡影响的实验中发现，透射电镜下不同剂量龙葵碱组肿瘤细胞图中均出现胞质空泡样变，核固缩以及明显的凋亡小体，随着龙葵总碱剂量的提高，自噬小体数量升高，自噬活性可能被上调，故引起骨髓瘤细胞凋亡的机制可能为龙葵总碱引起的强烈自噬减弱了骨髓瘤细胞的生存力。自噬在骨髓瘤细胞凋亡中起双刃剑作用［13］。一为抑制自噬诱导MM细胞凋亡，硼替佐米作为一种重要的抗骨髓瘤药物，目前认为其诱导骨髓瘤细胞凋亡的机制之一在于抑制未折叠或者错误折叠蛋白的降解，引起持续的内质网应激，引发内质网应激相关凋亡级联反应，进而促使细胞调亡。二为促进细胞自噬，当过度自噬时则有可能导致细胞死亡，即自噬性死亡。ZISMANOV等［14］团队证实细胞膜蛋白CD81和CD82在被重新转染表达于骨髓瘤细胞时，能致使细胞凋亡，而其根本途径由自噬性死亡执行。地塞米松是治疗MM的主要药物之一，其与硼替佐米联合使用时促使细胞自噬水平显著增强，进而扩增杀伤多发性骨髓瘤细胞［15］。

本研究结果为开发以龙葵总碱为主要成分的抗骨髓瘤靶点新药提供了实验基础，下一步研究将通过体内实验探究龙葵总碱如何调节相关基因促进骨髓瘤细胞凋亡。