姜黄素对膀胱癌大鼠组织病理学变化、炎症反应和氧化应激反应的影响▲

张欣雨 王智宇 赵文元 马保录 陶 涛

(1 青海省交通医院泌尿外科，西宁市 810008，电子邮箱：mnwk5825@sohu.com；2 郑州大学第一附属医院泌尿外科，河南省郑州市 450000；3 青海大学附属医院泌尿外科，西宁市 810008)

膀胱癌是泌尿系统中发病率最高的恶性肿瘤，临床上常采用手术联合经膀胱灌注进行治疗，虽然该方法的疗效较好，但是肿瘤复发仍然是膀胱癌治疗中亟待解决的一大难题[1-4]。姜黄素是从姜黄科植物中提取得到的有效成分，在莪术、姜黄等中药材的根茎中含量较多。有研究表明，姜黄素对宫颈癌、卵巢癌及淋巴癌细胞的增殖具有明显的抑制效果，是较为广谱的肿瘤抑制化合物，且毒性及副作用很小[5-8]。但目前有关姜黄素对膀胱癌的治疗作用及其作用机制的研究相对较少。有学者指出，机体微环境氧化应激反应亢进和抗氧化酶的活力受损在膀胱癌的发展过程中发挥重要作用，此外，炎症反应也参与了膀胱癌的发展过程[9-13]。本研究分析姜黄素对膀胱癌模型大鼠的干预效果，以及对膀胱癌大鼠机体炎症反应、氧化应激反应的影响，为膀胱癌的治疗提供新思路。

1 材料与方法

1.1 实验动物 选取100只健康雄性5周龄SD大鼠(购自中科院动物研究所，许可号：2019A210)，体重140～160 g，实验前于21℃～24℃饲养条件下，适应性喂养1周。

1.2 实验试剂和仪器 N-丁基-N-(4-羟丁基)亚硝基胺[N-butyl-N-(4-hydroxybutyl)-nitrosamine,BBN]购自日本化成工业株式会社(批号：20190203)，姜黄素购自西安正东生物科技有限公司(纯度>98%，批号：458-37-7)，白细胞介素1β(interleukin,IL-1β)酶联免疫吸附检测(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)试剂盒(批号：20190217)、C反应蛋白(C-reactive protein,CRP)ELISA试剂盒(批号：20190621)、转化生长因子β1(transforming growth factor β1，TGF-β1)ELISA试剂盒(批号：20201202)均购自南京森贝伽生物科技有限公司，自由基一氧化氮(批号：20181208)、丙二醛(批号：20200211)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)(批号：20191211)、总抗氧化能力(total antioxidant capacity,T-AOC)检测试剂盒(批号：20200209)均购自日本同仁化学公司。酶标仪(SuPerMax 3000FL)购自上海闪谱生物科技有限公司，电动移液器购自北京金时速仪器设备有限公司，高速离心机(型号：MiniSpin)购自浙江纳德科学仪器有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 分组及建模方法：按照随机数字表法，将100只雄性SD大鼠分为对照组、模型组、60 mg/kg姜黄素组、120 mg/kg姜黄素组，各25只。使用200 mg/0.5 mL BBN(按乙醇：水为1 ∶4的比例，配制成BBN混悬液)，以200 ms/0.5 mL的速度对模型组和姜黄素组大鼠进行灌胃，对照组大鼠给予等量的生理盐水进行灌胃，2次/周，每次时间间隔为2～3 d，连续灌胃8周。8周后通过CT扫描观察大鼠膀胱组织，正常膀胱组织黏膜光滑，未见肿块，若组织黏膜出现异常，并有新生肿块证明膀胱癌建模成功。本实验中模型组和姜黄素组大鼠均建模成功。

1.3.2 干预方法：从第一次BBN开始灌胃的前7 d开始，给予60 mg/kg姜黄素组和120 mg/kg姜黄素组大鼠相应剂量的200 μL姜黄素进行灌胃干预，1次/d，连续干预8周，之后给予200 μL生理盐水进行灌胃，1次/d，持续操作8个月；对照组及模型组大鼠则在相同时间段给予200 μL生理盐水进行灌胃，1次/d，持续操作8个月。各组中由于灌胃引发内脏受损或死亡的大鼠予以剔除，最终纳入对照组20只、模型组25只、60 mg/kg姜黄素组24只、120 mg/kg姜黄素组24只。

1.3.3 标本采集：灌胃结束后，收集各组大鼠股静脉血1～2 mL，室温条件下静置 25 min，随后在4℃下以2 000 r/min离心15 min，取上清分装于0.5 mL的EP管中，并储存于-20℃的冰箱中备用。

1.3.4 炎症、氧化应激指标的检测：采用ELISA法检测血清炎症指标IL-1β、CRP以及TGF-β1水平，采用硝酸还原酶法检测血清一氧化氮水平，采用硫代巴比妥酸法检测血清丙二醛水平，采用水溶性四唑盐法检测血清SOD水平，采用Fe3+还原法检测血清T-AOC水平，所有操作步骤均严格按照试剂盒的操作说明进行。

1.3.5 大鼠膀胱组织的病理变化：股动脉采血后采用颈椎脱臼法处死各组大鼠，剥离完整的大鼠膀胱，用10%的甲醛溶液固定膀胱组织后进行石蜡包埋，制作4 μm石蜡切片，常规进行苏木精-伊红(hematoxylin-eosin，HE)染色，显微镜下观察组织的病理变化，观察上皮组织增厚现象、膀胱细胞的层次、细胞核的大小均匀情况等，并行病理检测诊断膀胱癌的类型，包括浸润性尿路上皮癌与非浸润性膀胱尿路上皮癌。

1.4 统计学分析 采用SPSS 18.0软件进行统计学分析。计量资料以(x±s)表示，多组间比较采用方差分析，两两比较采用LSD-t检验；计数资料以例数(百分比)表示，比较采用χ2检验。以P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 4组大鼠血清炎症指标水平的比较 4组大鼠血清IL-1β、CRP及TGF-β1等炎症指标水平比较，差异均有统计学意义(均P<0.05)。其中，模型组、60 mg/kg姜黄素组大鼠的血清IL-1β、CRP和TGF-β1水平均高于对照组(均P<0.05)，而120 mg/kg姜黄素组大鼠的血清IL-1β、TGF-β1水平与对照组差异均无统计学意义(均P>0.05)，但血清CRP水平高于对照组(P<0.05)；60 mg/kg姜黄素组、120 mg/kg姜黄素组大鼠血清IL-1β、CRP及TGF-β1水平均低于模型组(均P<0.05)，且120 mg/kg姜黄素组大鼠血清IL-1β、CRP及TGF-β1水平均低于60 mg/kg姜黄素组(均P<0.05)。见表1。

表1 4组大鼠血清炎症指标水平的比较(x±s)

2.2 4组大鼠血清氧化应激指标水平的比较 4组大鼠血清氧化应激指标水平比较，差异均具有统计学意义(均P<0.05)。其中，模型组、60 mg/kg姜黄素组大鼠血清一氧化氮、丙二醛水平均高于对照组，血清SOD、T-AOC水平均低于对照组(均P<0.05)，而120 mg/kg姜黄素组大鼠血清丙二醛水平高于对照组、SOD水平低于对照组(均P<0.05)；60 mg/kg姜黄素组、120 mg/kg姜黄素组大鼠血清一氧化氮、丙二醛水平均低于模型组，血清SOD和T-AOC水平均高于模型组，且120 mg/kg姜黄素组大鼠血清一氧化氮、丙二醛水平均低于60 mg/kg姜黄素组，血清SOD、T-AOC水平均高于60 mg/kg姜黄素组(均P<0.05)。见表2。

表2 4组大鼠血清氧化应激指标水平的比较(x±s)

2.3 各组大鼠膀胱组织的病理变化情况 HE染色后，显微镜下可见对照组大鼠的膀胱组织正常(图1A)，而模型组和不同剂量姜黄素组大鼠的膀胱组织出现程度不同的癌变现象，均能够观察到增厚的被覆移行上皮组织，并且膀胱细胞的层次变多，细胞核的大小出现不均匀现象(图1B、C、D)；但与模型组相比，60 mg/kg姜黄素组大鼠膀胱组织的细胞层次变少(图1C)，120 mg/kg姜黄素组大鼠膀胱组织中部分细胞形态规则并且表现为不典型增生(图1D)。

图1 4组大鼠膀胱病理学改变(HE染色，×100)注：A、B、C、D分别表示对照组、模型组、60 mg/kg姜黄素组、120 mg/kg姜黄素组。

模型组、60 mg/kg姜黄素组、120 mg/kg姜黄素组大鼠膀胱癌病理类型比例比较，差异有统计学意义(P<0.05)，其中120 mg/kg姜黄素组非浸润性膀胱尿路上皮癌的比例高于模型组，而浸润性膀胱尿路上皮癌的比例低于模型组(P<0.05)。见表3。

表3 4组大鼠膀胱癌类型的比较[n(%)]

3 讨 论

膀胱癌是全球发病率位居第10的癌症，同时也是泌尿系统肿瘤中发病率排名第1的疾病[14]。据统计，相较于1990年，2017年全球膀胱癌的发病人数增长90%以上，死亡人数增长70%左右，60岁的老年人群发病率更高，随着我国进入老龄化社会，膀胱癌的发病以及死亡人数均呈上升的趋势[15]。膀胱癌的高发病率与环境和生产、生活习惯等息息相关，如何降低膀胱癌的发病率与复发率，已成为目前研究的热点。本研究采用BBN灌胃建立膀胱癌大鼠模型，结果显示模型组和不同剂量姜黄素组大鼠的膀胱组织均出现不同程度的癌变现象，表明建模成功。与模型组相比，60 mg/kg姜黄素组大鼠膀胱组织的细胞层次变少，120 mg/kg姜黄素组大鼠膀胱组织中部分细胞形态规则，并且细胞表现不典型增生，表明姜黄素能够抑制膀胱细胞的癌变过程，大剂量姜黄素能够更为有效地减缓膀胱组织恶化的进程。此外，本研究结果显示，120 mg/kg姜黄素组大鼠中非浸润性膀胱尿路上皮癌的比例高于模型组，而浸润性膀胱尿路上皮癌的比例低于模型组(P<0.05)，进一步表明较高浓度的姜黄素对浸润性膀胱癌的发生与发展具有抑制作用。

相关研究表明，氧化应激反应与膀胱癌的发展有关[16-18]。Gecit等[17]研究发现，膀胱癌患者的血清T-AOC水平较健康者明显降低，而血清一氧化氮及丙二醛水平较健康者明显升高。吕夷松等[18]研究发现，与浸润性膀胱癌患者相比，非浸润性膀胱癌患者血清T-AOC和SOD水平均明显升高，丙二醛水平明显降低。本研究结果显示，模型组大鼠血清T-AOC及SOD水平均较对照组大鼠降低，而一氧化氮和丙二醛水平较对照组大鼠上升(P<0.05)，与上述研究结果相似。而经姜黄素灌胃干预后，60 mg/kg姜黄素组、120 mg/kg姜黄素组大鼠血清一氧化氮、丙二醛水平均低于模型组，血清SOD和T-AOC水平均高于模型组(均P<0.05)，表明姜黄素对膀胱癌发展的抑制作用可能与其抑制机体自由基产生、阻止机体脂质过氧化物的堆积以及激发抗氧化酶的活性有关。此外，本研究中120 mg/kg姜黄素组大鼠血清一氧化氮、丙二醛水平均低于60 mg/kg姜黄素组，血清SOD、T-AOC水平均高于60 mg/kg姜黄素组，说明较高浓度的姜黄素更能有效地抑制膀胱癌大鼠机体自由基的产生，具有更好的抗氧化效果。

膀胱癌的发生和发展过程中会伴有不同程度的炎症反应。有学者采用显微镜对膀胱癌及癌旁组织的病理现象进行观察，发现由膀胱癌旁组织开始就已经出现炎性细胞以及淋巴细胞的浸润[19]。还有研究表明，炎症基因(TP53、IL-6等)的多态性与膀胱癌之间存在相关性，表明膀胱癌的发生与炎症反应关系密切[20]。李庆等[21]研究发现，膀胱癌患者肿瘤组织中TGF-β1的表达水平与肿瘤临床分期、病理组织分级和淋巴结转移情况存在明显的相关性。CRP作为促炎因子刺激肝脏时可产生急性时相蛋白，当机体发生感染、创伤或者肿瘤时其水平上升尤其明显，Grimm等[22]发现，CRP水平越高，膀胱癌患者的预后越差，术后总生存时间越短。此外，IL-1β也是细胞内重要的促炎因子[23]。本研究结果显示，膀胱癌模型大鼠血清IL-1β、CRP、TGF-β1水平均高于对照组大鼠，而60 mg/kg姜黄素组、120 mg/kg姜黄素组大鼠血清IL-1β、CRP及TGF-β1水平均低于模型组(均P<0.05)，这提示膀胱癌大鼠体内炎症反应水平升高，而姜黄素可降低膀胱癌大鼠血清IL-1β、CRP及TGF-β1水平，姜黄素抑制膀胱癌模型大鼠的肿瘤发展可能与其对炎症反应的抑制相关；同时，本研究结果显示，120 mg/kg姜黄素组大鼠血清IL-1β、CRP及TGF-β1水平均低于60 mg/kg姜黄素组(均P<0.05)，说明较高浓度姜黄素对膀胱癌大鼠炎症反应的抑制效果更佳。

综上所述，姜黄素能够抑制膀胱癌大鼠的组织病理学进展，可能与其抑制机体炎症反应和氧化应激反应有关。然而，姜黄素对膀胱癌的治疗效果及作用机制，还需要结合临床试验结果进一步验证。