环指蛋白187过表达后对人脑胶质瘤细胞U87的影响

董俊强，裴美娟，黄生炫，李学文，滕 川

脑胶质瘤是一种中枢神经系统起源的最常见的恶性肿瘤，占颅内肿瘤的40%～50%，因其进展快、预后差，手术切除、放疗及化疗效果均欠佳，一直是困扰人类健康的难题[1,2]。胶质瘤高侵袭性的特点，是导致传统治疗方案失败的主要原因[3]，因此，探究胶质瘤侵袭潜在的机制是当前研究的热点。随着近些年对脑胶质瘤的深入研究，越来越多的脑胶质瘤靶点和生物标志物被发现[4]。最近环指蛋白187(ring finger protein 187，RNF187)进入研究人员的视野并证实，RNF187是一个含RING域的E3泛素连接酶，在肝细胞癌和非小细胞肺癌中过表达，并通过诱导肿瘤细胞上皮-间质转化(epithelial-to-mesenchymal transition，EMT)促进了肿瘤的发展[5,6]。然而，RNF187在胶质瘤细胞增殖、迁移和侵袭中所起的作用，至今仍然没有研究清楚。本研究试图探究RNF187对胶质瘤细胞恶性度的影响及其可能机制。

1 材料与方法

1.1 主要材料 人脑胶质瘤细胞系U87购自上海中科院细胞库。RNF187过表达腺病毒表达载体AAVrh.10 RNF187与腺病毒衣壳AAVrh.10 Negative购自云舟生物科技(广州)有限公司。 蛋白抗体RNF187、NLRP3、ASC、GSDMD及GSDME购自美国abcam公司，CCK-8、Trizol及去RNA酶处理的物品购自美国Sigma公司。RT-PCR引物由赛默飞世尔科技(中国)有限公司合成。Tranwell小室、细胞培养板及计数板购自美国康宁公司。 DMEM培养液、胎牛血清、胰酶等细胞培养试剂购自美国Gibco公司。

1.2 细胞培养及转染 U87细胞在37 ℃和含5% CO2的条件下用含10%胎牛血清、1% 100U/L青/链霉素的DMEM 培养液进行常规培养。实验分3组：对照组、阴性对照组和RNF187过表达组。阴性对照组和RNF187过表达组U87细胞分别加入等滴度纯化的腺病毒表达载体AAVrh.10 Negative、AAVrh.10 RNF187，对照组加入等体积PBS，共培养12 h。根据细胞的密度进行换液或者传代。每次传代时，加入2.5 μg/ml嘌呤霉素继续筛选稳定的细胞株，每隔1 d于荧光显微镜观察细胞GFP荧光强度，直至荧光强度无明显变化，无死亡漂浮的细胞。

1.3 qRT-PCR实验 使用Trizol试剂盒提取细胞内总RNA，利用反转录试剂盒将RNA反转录成cDNA链，利用Real-timePCR试剂盒检测细胞内各蛋白mNRA的表达，GAPDH作为内参。引物序列见表1。

表1 各蛋白基因引物序列

1.4 CCK-8(Cell Counting Kit-8)增殖试验 取细胞悬液约100 μl在具有完全培养液的96 孔板中培养至约5×103/孔(37 ℃、5% CO2)。用10 μl 的CCK-8处理后，相同条件下继续培养2 h，用酶标仪测定各孔在450 nm 处的吸光值。

1.5 细胞克隆形成实验 梯度倍数稀释对数生长期的各组细胞悬液，分别接种在培养皿中，培养2～3周。当培养皿中出现肉眼可见的克隆时终止培养。弃上清，4%多聚甲醛固定，吉萨姆染色液染10～30 min。

1.6 Transwell实验 利用无血清DMEM培养液重悬各组细胞至1×104/ml，取200 μl加入Transwell小室中，并将盛有细胞悬液的Transwell小室置于含有培养液的实验孔中培养24 h；取出Transwell小室，PBS清洗后，利用棉签擦去小室薄膜上层细胞后，结晶紫染色薄膜下层细胞后，置于显微镜下计数拍照。

1.7 Westernblot检测 取转染后72 h的各组细胞，破碎后提取蛋白质。使用BCA蛋白质测定试剂盒测量每个样品的总蛋白质量。各组提取等量蛋白50 μg，使用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质，半干转移至PVDF膜。10%脱脂奶粉4 ℃封闭1 h，然后在含一抗的10%脱脂奶粉的TBST缓冲液过夜：兔单抗NLRP3抗体(1∶1000)、兔单抗ASC抗体(1∶1000)、兔单抗GSDMD抗体(1∶1000)、兔单抗GSDME抗体(1∶1000)、兔单抗RNF187抗体(1∶1000)、兔单抗GAPDH抗体(1∶1000)。TBST冲洗4次，然后将膜与辣根过氧化物酶山羊抗兔(1∶10 000)二抗孵育2 h，TBST冲洗4次，ECL plus用于信号检测，Image J软件用于定量分析。

2 结 果

2.1 转染后U87细胞过表达RNF187 与对照组[(1.03±0.12)，(0.35±0.11)]和阴性对照组[(1.08±0.15)，(0.40±0.08)]相比，RNF187组的RNF187 mRNA及蛋白表达水平[(2.33±0.41)，(0.78±0.06)]明显升高(P<0.05)，而空白对照组和阴性对照组之间差异无统计学意义(P>0.05，图1)。光镜下可见RNF187组胶质瘤细胞肿胀膨大，细胞数目明显增多，细胞之间连接疏松，并有许多气泡状突出物(图2)。

图1 脑胶质瘤RNF187蛋白表达水平

图2 脑胶质瘤RNF187对U87细胞的影响(×200)A.对照组；B. Negative组；C. RNF187过表达组

2.2 RNF187过表达促进U87细胞增殖、迁移和侵袭 CCK-8实验结果显示，对照组与阴性对照组细胞增殖率[(1.45±0.11)vs.(1.43±0.13)]差异无统计学意义，RNF187过表达组细胞增殖率(2.24±0.16)高于其他两组(P<0.05)。克隆形成实验结果显示，对照组和阴性对照组细胞克隆数[(119.3±22.4)vs.(121.5±18.7)]差异无统计学意义，RNF187过表达组细胞的克隆数(313.4±22.9)高于其他两组，差异有统计学意义(P<0.05)。 transwell实验结果显示，对照组和阴性对照组相比穿膜细胞数[(84.3±11.5)vs.(79.5±10.2)]差异无统计学意义，而RNF187组的U87穿膜细胞数(226.4±12.6)较其他两组升高，差异有统计学意义(P<0.05，图3)。

图3 脑胶质瘤RNF187过表达对U87细胞transwell实验的影响(×200)A.对照组；B. 阴性对照组；C. RNF187过表达组

2.3 RNF187过表达促进U87细胞发生焦亡 RT-PCR和Western blot实验结果显示，对照组和阴性对照组相比焦亡相关mRNA及蛋白(NLRP3、ASC、GSDMD和GSDME)差异均无统计学意义，与对照组和阴性对照组相比，RNF187组焦亡相关mRNA及蛋白(NLRP3、ASC、GSDMD和GSDME)表达水平均明显升高(P<0.05，图4、表2、表3)。

图4 脑胶质瘤RNF187过表达对焦亡蛋白的影响

表2 脑胶质瘤焦亡蛋白相对表达量

表3 脑胶质瘤焦亡蛋白mRNA相对表达量

3 讨 论

胶质瘤是最危及生命的原发性脑肿瘤之一，其发生、发展是一个涉及抑癌基因和致癌基因间平衡的多步骤过程，受到多基因的调控[7]，胶质瘤导致患者死亡的主要原因是其侵袭和转移[8]。在这项研究中发现，与正常的脑胶质细胞组织相比，RNF187在胶质瘤细胞系U251、U87、A172、LN229和SHG-44中过表达，其中在U87细胞株表达水平最高。通过cDNA转染U87细胞，本研究提出过表达RNF187的胶质瘤细胞在体外具有高度侵袭和转移的潜能。现在，公认的是泛素化在翻译后蛋白质修饰中起着重要作用，调节着细胞许多的关键过程，如细胞周期、细胞凋亡和DNA修复[9]。因此，泛素化参与翻译后修饰，并在真核生物的不同生理和病理过程中起着至关重要的作用，泛素功能障碍与多种肿瘤的发生和发展有关[9]，包括肺癌[10]、大肠癌[11]、肝细胞癌[12]和胶质瘤。上述数据表明异常的RNF187可能是肿瘤发展的重要助推器。

本研究发现，RNF187过表达显著提高焦亡相关蛋白(NLRP3、ASC、GSDMD、GSDME)的表达水平，证明RNF187过表达能够促进胶质瘤细胞焦亡的发生。细胞焦亡与肿瘤的发生发展有关，是一种由gasdermin 蛋白家族介导的程序性死亡[13]。最近有研究表明，细胞焦亡促进早期肿瘤的发生[14]。此外，RNF187基因敲除被揭示通过抑制激活蛋白-1(AP-1)相关基因的转录来抑制细胞增殖，RNF187的过表达激活连环蛋白(Wnt)和Ras通路，从而加速结肠上皮中肿瘤的形成[15]。有研究表明，泛素E3连接酶调控NLRP3表达，NLRP3的组装导致caspase-1的激活，触发细胞因子白细胞介素(IL)-1β和IL-18的释放，激活细胞焦亡过程[16]。Wnt可以通过增加NLRP3和ASC之间的联系来促进NLRP3炎性小体激活[17]，并且多项研究表明NLRP3具有调控EMT的作用[18]。细胞焦亡还可促使肿瘤细胞转移，活化的NLRP3炎性小体可促进肿瘤细胞的生长增殖[19]。凋亡的典型特征之一是由GSDMD引起的质膜孔的形成[20]。以上研究表明RNF187过表达可以激活细胞焦亡途径，这可能是促进胶质瘤细胞增殖、侵袭的关键。

总之，RNF187可通过细胞焦亡相关分子通路作用于脑胶质瘤细胞促进其恶性演进。