CEA阳性细胞系的鉴定及其荷瘤小鼠模型建立

吕开绩，张丽芳，卢叶挺，王高卿，周新华

CEA是一种来源于机体内胚层上皮组织的糖蛋白，正常情况下人体血清中的CEA 含量极低。一旦正常机体出现肿瘤细胞异常增生时，CEA 会失去极性，之后过度表达。之后，在磷脂酶作用下，细胞表面的CEA 可以进入血清，导致血清CEA 的增加。目前临床上常规检测血清CEA 含量以动态观察肿瘤的发生发展。CEA 可以在某些恶性肿瘤包括结肠直肠癌、胃癌[1-2]、肺癌[3-4]、胰腺癌[5]和其他癌症中过度表达。其在癌细胞粘附、迁移和侵袭中起着重要作用。因此，CEA 已经成为免疫治疗的靶标。本研究分别选取了人大肠癌细胞株HT-29、人胃癌细胞株M KN-45 及人宫颈癌细胞株Hela，利用RT-PCR、Wesern Blot 以及免疫荧光对3 种细胞株中的CEA 表达情况进行验证；随后利用3 种细胞分别建立荷瘤小鼠模型，为CEA 阳性肿瘤的发病基础以及治疗提供了肿瘤模型基础。

1 资料与方法

1.1 材料及试剂 人大肠癌细胞株HT-29、人宫颈癌细胞株Hela 购自上海中科院细胞库，人胃癌细胞株 MKN-45 购自中国典型培养物保藏中心（CCTCC）。细胞培养基Basic RPMI-1640、DMEM、胎牛血清（FBS）、EDTA-胰酶购自Gibco 公司。CEA多抗购自abcam 公司。细胞培养用6 孔板、24 孔板、小号培养皿、细胞冻存管购自康乐实验器材公司。4～5 周龄，健康未孕的雌性BALB/c-nu小鼠，体质量10～15 g，18 只，购自南京生物医药研究院，按照GB-14924.3-2001/GB14924.2-2001 营养标准配制小鼠饲料，IVC-II 型独立通风系统，保持恒定温度（22±2℃）和湿度（40%～70%），饮用水均为高压灭菌水，每日光照与无光照各12 h 饲养于温州医科大学动物实验中心SPF 级实验室。

1.2 方法

1.2.1 RT-PCR 设计CEA引物：上游引物序列为：5’ATGGAGTCTCCCTCGGCCCCTC3’；下游引物序列为：5’ATCTGACTTTATGACGTGTAGGG3’，由擎科生物公司进行合成。复苏HT-29、MKN-45 及Hela 细胞，提取RNA：常规方法复苏，传代以上3 种细胞株，收集培养瓶内细胞，使用Trizol法提取RNA。提取的总RNA使用紫外分光光度计测量获得A260 nm 和A280 nm 的吸光光度值。根据A260nm的吸光光度值计算获得RNA浓度。RT-PCR：取2g RNA 进行逆转录，逆转录产物经过聚合酶链式反应扩增获得目的基因CEA。PCR循环条件：94 ℃预变性3 min，94 ℃1 min，55 ℃1 min，72℃1 min，35 个循环，72℃末延伸5 min。扩增产物使用1%琼脂糖凝胶电泳检测，后成像拍照。

12.2 Western Blot 用六孔板分别培养3株细胞株，长至合适密度时，取出培养板后将其至于冰上，每孔加入1 ml的细胞裂解液（含10l 的PMSF），裂解30 min。之后用细胞刮棒将细胞集中于一侧，用移液枪多次吹散细胞液后，收集细胞液至1.5 ml 离心管中。4 ℃下12000 r/min 离心5 min，将离心后的上清分装用作跑胶的样本。跑胶：每个孔以10l 的量加样，电压调整为30 V后，跑胶1 h，再将电压调到100 V，继续电泳直至蛋白marker 分开。剪好大小合适的PVDF 膜用于接下来的转膜实验，转膜时间为15 min。用3%TBST 配置的牛奶封闭1 h，将牛奶吸出后，轻轻冲洗PVDF 膜，加入1∶1000 稀释的CEA 多抗，37℃孵育2 h。后用TBST洗5 遍，每次5 min，然后加入1∶1000 HRP 标记羊抗鼠，37 ℃孵育1 h。加AB 显色液室温下5 min 显色。

1.2.3 细胞免疫荧光 复苏HT-29、MKN-45 及Hela细胞，在对应的细胞长至80～90%时，用胰酶消化完细胞，然后用1 ml的完全培养基（对应的培养基内加入10%的FBS）重悬细胞，用滴管加3 滴细胞悬液到24 孔板内。等至细胞长至合适密度，取出培养箱内的24 孔板，首先用PBS 清洗一遍细胞，然后在每个孔内加入200l 的多聚甲醛固定细胞，37℃放置15 min。用PBS洗一遍后加入0.3%的Triton，用20%的FBS 封闭细胞，37 ℃，2 h。敷一抗：弃去封闭液，首先用20%BSA以1∶1000 的比例稀释CEA多抗，然后在24 孔板内添加200l 的一抗稀释液，4℃放置过夜。敷二抗：弃去一抗，用PBST 洗3 次，然后在闭光条件下用PBST以1∶1000 的比例稀释FITC标记的羊抗鼠，之后在每个孔内加入200l 对应的稀释后的抗体，37℃放置2 h。用PBST 洗5 次，保持爬片内湿润，在每个爬片上添加20l hochest，37℃染10 min，然后PBS 清洗。抗淬灭剂至载玻片上，然后把爬片上细胞这一面改至载玻片上，防止玻片上荧光的猝灭。后置于400 倍显微镜下进行拍片。

1.2.4 荷瘤小鼠肿瘤模型的建立 细胞复苏，传代以及冻存的方法如上.细胞接种：将处于对数生长期的细胞消化离心后，用无血清的1640 重悬细胞，利用细胞计数板，将其细胞密度调整为2×107/ml，在30 min内将细胞悬液接种到裸鼠的右侧肩胛骨下，每只小鼠接种200l。接种细胞后，每天观察荷瘤小鼠生长情况，每两天进行拍照记录并且测量肿瘤大小。测量肿瘤大小时，将测得到的肿瘤长径记作为a，短径记作为b，按V=0.5ab2的公式计算肿瘤大小[6]，以肿瘤体积和生长周数分别为坐标绘制的肿瘤生长曲线。

1.3 统计方法 采用SPSS20.0 软件进行数据分析，计数资料采用2检验。P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 3 株细胞中CEA的表达情况 HT-29、MKN-45细胞系在分子质量约400 bp 处可见单一条带，而Hela 细胞系中未见明显条带。HT-29、MKN-45 细胞中有CEA 表达，而Hela 细胞则没有CEA 表达。见封二彩图3。

图3 各细胞系中CEA 的表达情况

2.2 HT-29、MKN-45 及Hela 细胞中CEA 蛋白的表达情况 HT-29、MKN-45 细胞在180 kDa 可出现一条明显的条带，可见CEA 蛋白表达，而Hela 细胞中未见明显的CEA 蛋白的表达。见封二彩图4。

图4 各细胞系中CEA 蛋白表达情况

2.3 各细胞系中CEA 天然蛋白的表达情况 孵育CEA 多抗的HT-29、MKN-45 的细胞，在胞膜的位置上出现明显绿色团块样的荧光，而Hela 细胞中无绿色荧光出现，孵育PBS 的3 株细胞中均未出现明显的绿色荧光。见封二彩图5 及封三彩图1。

图1 PBS 与天然CEA 特异性结合的细胞免疫荧光

2.4 荷瘤小鼠模型的建立及成瘤情况 本组18 只裸鼠全部存活，且成瘤率为100%。MKN-45 荷瘤小鼠的成瘤潜伏期为（6.3±1.5）d，HT-29 成瘤潜伏期为（6.0±2.2）d，而Hela细胞的成瘤潜伏期为（10.0±1.6）d。MKN-45、HT-29 细胞的成瘤时间明显短于Hela 细胞。MKN-45、HT-29 肿瘤长至200～300 mm3所需时间大约为2 周，而Hela 细胞需要4 周。见封三彩图2 及图1～2。

图1 荷瘤小鼠肿瘤体积生长曲线

图2 不同时期荷瘤小鼠肿瘤体积比较（*＜0.01）

图2 各细胞系对应裸鼠成瘤图

谢佩玲，张俐娜，何娜，等.骨髓间充质干细胞玻璃体腔内注射对外伤性视神经损伤的修复作用研究（见正文第1411 页）

3 讨论

1965 年，CEA首次从结肠癌患者组织中分离出来，目前已是常见的肿瘤标志物。CEA 在某些特定的恶性肿瘤中过度表达，尤其在消化道肿瘤中，其阳性率可达到90%，因此术前检测CEA可对肿瘤患者的诊断、分期以及预后判断有重要意义[7-8]。既往已有报道CEA 阳性细胞株为MKN-45[9]、HT-29[10]，但对其验证缺少具体文献支持。为了深入研究特定肿瘤的发生发展及其治疗和相关预后，动物模型的挑选以及建立在此方面起着重要作用[11-12]。

本研究首先对利用RT-PCR 在基因水平对MKN-45 细胞、HT-29 细胞及Hela 细胞中的CEA 表达情况进行了验证，发现CEA在前两者细胞中表达，而在Hela 细胞中未见明显表达。然后利用Western Blot 验证了CEA 蛋白在以上3 株细胞系中的表达情况，结果和RT-PCR 结果相一致。而后利用免疫荧光技术对3 株细胞系中天然存在的CEA 蛋白进行验证，发现在MKN-45、HT-29 细胞的胞质中出现了绿色斑点，说明CEA 在这两种细胞的天然表达，而且存在于胞质中。

动物模型的建立对研究肿瘤的发生以及治疗有重要的意义，理想的动物模型要求其发生部位、类型、病因、发生机制及其生物学行为等方面符合所研究的人类肿瘤。至今为止，荷瘤小鼠动物模型的建立主要分为4 大类，分别为自发性肿瘤模型、诱发性肿瘤模型、基因修饰肿瘤模型和移植性肿瘤模型[15]。相对而言，移植性肿瘤模型在以上4 种动物模型建立中具有其独特的优点。首先，移植性肿瘤模型制作简便、操作性好，荷瘤裸鼠模型成功率较高且对动物损伤小、死亡率低，研究的可重复性好。更为重要的是，裸小鼠的遗传背景明确，性状稳定，因免疫缺陷而不发生免疫排斥反应[16]，可进行体表部位肿瘤移植而形成体表移植瘤。经过预实验的摸索后最终选择细胞终浓度为2×107/ml 进行接种，所有荷瘤小鼠全部成瘤，成瘤率达到100%。通过观察，笔者发现实验中所有的裸鼠均未出现其他重要脏器转移的情况。不足的是肿瘤长大后形状趋于不规则，多数呈分叶状，无法更精准的测量到肿瘤长径和短径。在今后的实验的可能需要更加完善的接种方案。在接种后的早期，裸小鼠的局部皮肤长出小囊肿，而后囊肿逐渐增大，后长出实体瘤组织，随着肿瘤体积的逐渐增大，裸鼠的体质量减少明显。而后出现恶质病，肿瘤体积增长速度慢慢减缓。

由于对晚期恶性肿瘤的综合治疗，免疫治疗已日益成为有效抗肿瘤研究的热点。然而，目前，现有的动物模型不能准确地描述人类组织与肿瘤细胞之间的相互作用。此外，由于物种差异，在与人类相同的小鼠模型中重建免疫系统和微环境是一个艰巨的障碍。近年来，CEA 已经成为免疫治疗的靶标。放射性标记的单克隆抗体已经被开发用于诊断和治疗CEA 阳性肿瘤。尽管如此，单克隆抗体由于表现出缓慢的血液清除速率以及在肝脏的高摄取率对于其用作癌症靶向探针是并不是十分理想的。较小的抗体片段，如抗原结合片段（Fab）和单链可变片段的，特别是纳米抗体，由于它们的具有快速代谢和肿瘤的高摄取以及更好的药代动力学这些特点使得他们近年来被用作肿瘤靶向探针。

与其他实验相比，本实验选取了较常见肿瘤的细胞株，从基因、分子、细胞水平分别验证了各种细胞系中CEA 的表达情况，最后成功建立了荷瘤小鼠模型，为后期CEA 阳性肿瘤的免疫治疗研究奠定了动物实验基础。