超声对厌氧氨氧化污泥富集培养过程的影响研究*

2021-12-28曾燕玲秦永丽黄清辉黎小源陈瑞红蒋永荣邱雨辰姜峙成施亚雯

环境污染与防治 2021年12期

曾燕玲秦永丽# 黄清辉黎小源陈瑞红蒋永荣邱雨辰姜峙成施亚雯

(1.桂林电子科技大学生命与环境科学学院，广西桂林 541004；2.广西博世科环保科技股份有限公司，广西南宁 540000)

随着社会的发展，氨氮的排放量急剧增加，造成水环境污染和富营养化等问题[1-2]。传统生物脱氮主要通过微生物的硝化及反硝化作用实现，它对废水脱氮起到重要作用，但仍存在诸多问题，如能耗大、需额外添加有机碳源、剩余污泥多等[3-4]。厌氧氨氧化(Anammox)工艺由于节省碳源和能源、污泥产量少等优点被认为是最具应用前景的新型脱氮工艺之一[5]，它主要涉及一种化能自养厌氧菌——厌氧氨氧化菌(AnAOB)，该菌能够以亚硝酸盐氮为电子受体在厌氧条件下将氨氮转化为氮气[6]。目前Anammox工艺主要应用于垃圾渗滤液[7]、养猪场废水[8]、生活污水[9]等含氨氮废水处理中，脱氮负荷可高达76.5 kg/(m3·d)[10]。但是，Anammox工艺的启动时间长(145～298 d)，污泥富集难[11-13]，大大限制了它在实际工程中的应用。对于Anammox工艺启动慢、污泥富集难的原因，研究者认为：一是AnAOB倍增时间长，生长缓慢[14]；二是AnAOB易受环境的影响[15]，如基质的突变、温度的降低、有机物的添加等，均会导致污泥活性降低，AnAOB丰度大幅下降[16-18]。而含氨氮的工业废水多为间歇排放，水量波动较大，且有毒污染物较多，水质较为复杂，以及环境参数(如温度)不易控制等，均会造成系统内AnAOB生长受影响，从而Anammox污泥难富集。因此，如何加快AnAOB的生长，实现Anammox污泥的快速富集是推进Anammox工艺推广应用的关键。

超声处理因其效率高、仪器简单，与其他常规技术相比大大缩减了处理时间以及经济上的负担而被认为是一种实用的技术[19-20]。目前低强度超声处理技术已广泛应用于废水生物处理领域[21]，其机械效应、热效应等会使细胞膜变薄，加快传质过程，增强酶活性，促进微生物生长，达到提高反应效率的目的[22]。段秀梅[23]58通过透射电子显微镜观察发现，经超声处理后的生物细胞壁比未经处理的薄1.1 nm。唐欣等[24]认为，超声处理能够明显促进短程硝化反硝化过程中氨单加氧酶的活性，酶活性的增加加快了短程硝化污泥反应速率。然而由于不同的微生物适宜的超声强度不同，需选择性地控制超声条件使目标菌群活性增强并且抑制其他菌群的活性[25],[26]1591,[27]283，而Anammox污泥富集培养的过程就是AnAOB生长及其他菌群(如硝化菌、反硝化菌)被淘汰的过程。多位研究者通过短期批次实验发现当超声强度为80～200 W，照射时间为3～5 min时，可明显增强Anammox污泥活性[23]58,[28]1358。张鑫爱[29]在研究低强度超声强化含氮废水生物脱氮研究时发现，180 W时，硝化菌、反硝化菌属的占比均降低，而AnAOB的占比升高。由此可见超声在AnAOB的生长和选择富集方面具有优势。然而，目前的研究主要集中在超声参数(如超声强度、超声时间、超声作用周期)对AnAOB的短期强化效果及其初步的强化机理等方面[23]58,[28]1358，针对特定低强度超声下Anammox污泥富集培养的长期强化效果报道较少。因此本研究拟采用低强度超声强化Anammox污泥的富集，在参照前人的研究基础上选择适宜的超声参数，在超声条件下，采用厌氧序批式反应器接种处理养殖沼液的自然塘污泥富集驯化Anammox污泥，考察污泥长期驯化过程中反应器的脱氮性能和微生物群落结构的变化情况，旨在为Anammox污泥的快速富集培养和Anammox工艺的应用推广提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验装置

实验在两个平行运行的有效容积为1.5 L的厌氧序批式反应器中进行，其中一个为对照组(R1反应器)，另一个与超声清洗机(KQ250DB)耦合作为实验组(R2反应器)。反应器每个循环的运行时间为24.0 h，包括进水(20 min)、混合反应(22.0 h)、静置(1.5 h)、出水(10 min)。实验组根据反应器运行效率，定期使用超声清洗机超声处理污泥。超声方法：在排水后，将反应器中全部泥水混合物置于血清瓶中，并将血清瓶置于超声清洗机中，超声功率为180 W，超声时间为5 min，处理后将泥水混合物倒回反应器中进行富集驯化。装置示意图见图1。

图1 装置示意图

1.2 接种污泥与模拟废水

接种污泥为处理养殖沼液的自然塘污泥，污泥颜色为黑色，其混合液悬浮固体(MLSS)质量浓度为27.87 g/L，混合液挥发性悬浮固体(MLVSS)质量浓度为18.35 g/L，MLVSS/MLSS=0.66。

模拟废水[30]：氨氮和亚硝酸盐氮分别由NH4Cl和NaNO2按需配置，KH2PO410 mg/L，KHCO31 250 mg/L，CaCl2·2H2O 5.6 mg/L，MgSO4·7H2300 mg/L，微量元素浓缩液各1.0 mL/L，微量元素浓缩液组成见表1。

表1 微量元素浓缩液组成

1.3 实验方法

将未经超声处理和经超声处理后的污泥分别接种于R1、R2反应器，采用智能温控电伴热带(WK-SM3)将反应器内的温度控制在(33±1) ℃，固定水力停留时间(HRT)为24.0 h，维持进水氨氮250 mg/L和亚硝酸盐氮350 mg/L不变，3 d取一次水样测定反应器内的氮去除情况，待R2反应器去除效率稳定或与R1反应器较接近时，再次对R2反应器的污泥进行超声强化，待氨氮基本去除后驯化结束，整个驯化过程历时56 d。

1.4 分析项目及方法

氨氮、亚硝酸盐氮、MLSS和MLVSS的测定按照文献[31]进行；胞外聚合物(EPS)采用超声提取法提取，用Folin-Lowry法测EPS中蛋白质(PN)，用蒽酮法测EPS中多糖(PS)[32]；污泥微生物形态用扫描电子显微镜(SEM，Quanta 200FEG)观察。微生物群落结构：在驯化初期、中期、后期(分别为第1、38、56天)从R1和R2反应器中取泥(驯化初期R1和R2反应器的泥样分别命名为R1.1和R2.1，中期为R1.2、R2.2，后期为R1.3、R2.3)，将污泥样品冷冻保存后送至北京某公司测序分析。荧光原位杂交(FISH)分析：驯化末期(第56天)，从反应器内取泥进行FISH实验，其所用的探针见表2[33]。

表2 FISH所用探针信息

2 结果与讨论

2.1 脱氮性能的变化情况

图2和图3分别为污泥富集培养过程中氨氮和亚硝酸盐氮的变化情况。由于养殖沼液中含有较高浓度的氨氮，处理养殖沼液的自然塘污泥也具有一定的脱氮能力(如Anammox或反硝化能力)[34]1306，驯化初期(第3天)，未加载超声的R1反应器的氨氮和亚硝酸盐氮的出水质量浓度分别为250.51、330.10 mg/L，其去除量分别为10.54、12.53 mg/L。加载超声的R2反应器，第3天氨氮和亚硝酸盐氮的出水质量浓度分别为240.08、320.23 mg/L，其去除量分别为17.98、32.40 mg/L，氨氮和亚硝酸盐氮的去除效率分别是R1反应器的1.7、2.6倍。文献[23]、[35]表明，超声处理后，机械效应、热效应等会使细胞膜变薄，加快传质过程，增强酶活性，促进微生物生长，提高反应效率。随后R1反应器的出水氨氮和亚硝酸盐氮浓度呈波动趋势，R2反应器的出水氨氮和亚硝酸盐氮浓度则不断降低，明显低于R1反应器，至第38天时，R2反应器的出水氨氮和亚硝酸盐氮浓度降低趋势减弱，其出水质量浓度分别为206.85、244.08 mg/L，去除量分别为65.78、95.56 mg/L，亚硝酸盐氮、氨氮转化比为1.45∶1.00。R1反应器在第38 天的氨氮和亚硝酸盐氮的去除量仅分别为62.61、52.96 mg/L，亚硝酸盐氮、氨氮转化比为0.85∶1.00。R2反应器的氨氮去除效率仅比R1反应器高22.65%，明显低于驯化初期，推测超声的优势作用在逐步消失，多位研究者发现超声对AnAOB作用的最适周期为6～7 d[23]56,[28]1358，但本研究持续至38 d时仍有一定的优势，说明在污泥驯化过程中超声的作用周期可以更长，推测驯化前期超声的作用使得R2反应器中AnAOB的活性明显大于R1反应器，同时伴随有其他同向富集效应如EPS的增加(具体分析见2.2节)[23]56，使AnAOB更趋于富集团聚，从而表现出在污泥富集驯化过程中超声的作用周期长于6～7 d。

图2 氨氮的变化

图3 亚硝酸盐氮的变化

为了进一步强化AnAOB的富集，在38 d时，对R2反应器的污泥进行二次超声强化。二次超声强化后，R2反应器的去除性能不断得到提升，至56 d时，R2反应器的氨氮基本去除完全，其氨氮和亚Table 2 The message for FISH probesFig.2 Changes of ammonia nitrogen

Fig.3 Changes of nitrite nitrogen硝酸盐氮的去除量分别为228.09、273.88 mg/L，亚硝酸盐氮、氨氮转化比为1.20∶1.00，接近于Anammox理论转化比(1.32∶1.00)，同时伴随有硝酸盐氮的生成和氮气的产生，由此可见Anammox污泥在一定程度上得到了富集。38～56 d期间，R1反应器的氨氮出水浓度逐步降低，至56 d时，R1反应器的出水氨氮质量浓度为144.54 mg/L，去除量为91.14 mg/L；而此过程R1反应器的出水亚硝酸盐氮浓度有升高，由低于进水逐步升高至高于进水，至56 d时，R1反应器的出水亚硝酸盐氮质量浓度为418.07 mg/L，比进水高53.96 mg/L，说明系统内亚硝酸盐氮消耗反应在减弱，亚硝酸盐氮生成反应在增强，即Anammox反应在减弱，氨氧化或反硝化反应在增强，其对应的功能微生物表现出同样的变化趋势(具体分析见2.3节)。

综上所述，以处理养殖沼液的自然塘污泥为种泥，在180 W 5 min超声2次强化下，经56 d可成功实现Anammox污泥的富集培养，其富集培养时间相比于常用的强化富集方法，如添加填料载体(93 d)[36]、铁元素(87 d)[37]等明显缩短。富集培养的Anammox污泥的氨氮和亚硝酸盐氮去除速率分别为228.09、273.88 mg/(L·d)，亚硝酸盐氮、氨氮转化比为1.20∶1.00。

2.2 污泥外观和EPS的变化情况

污泥驯化过程中，R2反应器污泥的颜色由最初的黑色逐步变为红棕色，而R1反应器污泥的颜色由最初的黑色逐步变为黄棕色。为了进一步了解污泥的微生物形态，对驯化后期(第56天)的污泥进行SEM观察，结果见图4。在R2反应器驯化末期的污泥中发现了大量的球状菌(见图4(b))，推测为AnAOB，但在R1反应器中并未见明显的球状菌存在(见图4(a))。

图4 R1和R2反应器驯化末期污泥SEM图

驯化过程中，污泥表面EPS的变化情况见表3。经超声处理1 d后的R2反应器的PN、PS质量浓度分别为48.44、28.39 mg/g，高于R1反应器的34.46、17.69 mg/g。由此可见，超声处理可使污泥的EPS增多[23]56。经第1次超声强化后，随着污泥进一步驯化，R2、R1反应器的PN和PS均呈逐步增加的趋势，且R2大于R1。研究表明，在Anammox污泥驯化过程中，高EPS有利于AnAOB间的相互黏附、聚集和信息交流[38-39]。由此可见R2反应器经短期超声强化后，EPS的分泌量增加，增加的EPS使AnAOB同向聚集效应增加，利于Anammox污泥富集，使得超声强化作用周期延长。经第2次超声强化，至56 d时，R2反应器的PN、PS分别增长至70.10、32.13 mg/g，同时PN/PS也在逐步增加。研究表明较高的PN/PS使得Anammox污泥的活性、稳定性和沉淀性能更强[40]，这说明本研究以处理养殖沼液的自然塘污泥为种泥，经超声强化后，Anammox污泥逐步得到了富集。而R1反应器污泥EPS的分泌量在减少，PN/PS也在降低，说明R1反应器的污泥性能在恶化，与脱氮性能的变化趋势相符。

表3 污泥表面EPS的变化情况

2.3 微生物群落结构的变化情况

Anammox污泥富集培养过程中，门水平的微生物群落结构变化情况见图5。从图5可以看出，污泥富集前后微生物群落结构变化差异较大。驯化初期厚壁菌门、拟杆菌门相对丰度较大(在图5中的颜色较深，相对丰度>10%)，后期，R1和R2反应器的厚壁菌门、拟杆菌门均大幅减少(在图5中的颜色逐步变浅)。变形菌门(多数氮转化菌所在的门类)在R1和R2反应器中的相对丰度则明显增加(在图5中的颜色逐步变深)，在驯化后期增加至30%左右。由此可见R1和R2反应器内均存在较高丰度的脱氮菌。AnAOB所在的浮霉菌门在R2反应器中表现出明显增加的趋势(在图5中的颜色由浅逐步变深)，而在R1反应器中则表现出先升高后降低的趋势(在图5中的颜色先由浅逐步变深最后再变浅)。从脱氮菌属水平的变化结果(见表4)可知，R2反应器内富集的AnAOB菌主要为待定库氏菌、待定杰特氏菌，这与处理养殖沼液等常规系统富集的待定布罗卡地菌(CandidatusBrocadia)有所不同[34]1306,[41]，由此可见超声作用对AnAOB菌属种类的富集存在选择性差异。另外在驯化后期，R1、R2反应器中均发现了大量的反硝化菌(如红杆菌、芽孢杆菌、脱硝弯杆菌等)，但R1反应器的反硝化菌的相对丰度总和22.769%均明显大于R2反应器的17.726%；且R2反应器的硝化细菌的相对丰度总和0.332%大于R1反应器的0.084%。由此可见经56 d的富集培养后，经超声处理的R2反应器的AnAOB相对丰度在增加。而未经超声处理的R1反应器的AnAOB相对丰度在减少，但其反硝化菌的丰度在大幅增加，因此R1反应器后期亚硝酸盐氮消耗反应在减弱，亚硝酸盐氮生成反应在增强，表现为出水亚硝酸盐氮浓度大于进水，与2.1节亚硝酸盐氮的变化趋势相符。多位研究者发现选择性地控制超声条件能够使目标菌群活性增强并且抑制其他菌群的活性[26]1591,[27]283，因R2反应器中施加了180 W 5 min超声，抑制了部分反硝化菌的活性，促进了AnAOB的富集，因此R2反应器中AnAOB的相对丰度较高。此外，对驯化后期的污泥进行FISH分析，R2反应器中的AnAOB表现出一定强度的红色荧光信号，而R1反应器的污泥中并未发现明显的红色荧光信号，这与高通量测序、SEM和氮的去除效率结果一致，进一步佐证了超声在Anammox污泥的富集培养方面具有一定的优势。