玉米单倍体诱导加倍技术在实践中的应用

王 东 郑 威 冯 晔 王春雷 王 丹 高丽辉 张建华包额尔敦嘎 张 超 金 虎 丁 宁 刘涵淼

（通辽市农业科学研究院 内蒙古通辽028015）

玉米是我国第一大作物，随着人口的增加和耕地的不断减少，生产上对高效、优质、抗逆性强的玉米品种的需求日趋迫切，这就要求我们出好品种、快出品种。而常规育种周期较长、选择效率较低，育成一个玉米新品种需要经历10 年左右，其中选育优良自交系要经历5～7 年，这样很难满足出好品种、快出品种的要求。单倍体技术、基因工程技术、分子标记辅助育种技术与常规育种技术的有机结合，大大缩短了自交系的选育年限，使常规选系的5～7 年缩短为 1～2 年。

1 单倍体诱导技术

单倍体诱导技术在育种中的应用主要分为两个阶段：一是优良基础群体材料的诱导阶段。本阶段根据基础材料的不同，可以选择F1代或F2代、F3代进行诱导。诱导时，以基础材料为母本、优良诱导系为父本进行杂交，秋季挑选胚乳糊粉层紫色胚无色的籽粒为准单倍体备用加倍处理；胚乳糊粉层紫色胚紫色的籽粒和胚乳糊粉层无色胚无色的籽粒均淘汰。二是拟单倍体的加倍过程。准单倍体的加倍方法主要有自然加倍法和人工药物处理加倍法。由于自然加倍率很低，现在大多数科研单位均采用人工药物加倍方法，其中采用最多的是秋水仙素加倍处理方法。

秋水仙素是诱导多倍体效果最好的药剂之一。它的作用机理：当细胞进行分裂时，一方面能使染色体的着丝点延迟分裂，于是已复制的染色体两条单条分离，而着丝点仍点连在一起，形成“X”形染色体图像；另一方面是引起分裂中期的纺锤丝断裂，或抑制纺锤体的形成，结果到分裂后期染色体无微管牵引不能移向两极，而重组成一个双倍性细胞核。这时，细胞加大而不分裂，或者分裂成一个无细胞核的子细胞和一个有双倍性细胞核的子细胞。经过一个时期以后，这种染色体数目加倍了的细胞再分裂增长时，就构成了双倍性的细胞和组织。

2 秋水仙素加倍流程

2.1 试剂和设备工具的准备

试剂主要包括：Col（秋水仙素）、DMSO（二甲基亚砜）、蒸馏水、酒精、次氯酸钠；设备工具主要包括人工发芽室、冰箱、通风橱、防毒面具、手套、量筒、烧杯、带封闭盖的大玻璃瓶、大片滤纸、毛巾、托盘、喷壶、刀片、小沙网袋、浸泡桶等。

2.2 种子发芽前处理

首先把准单倍体种子浸泡在温清水中6 h；其次是在托盘上放置一条沾湿的毛巾，在毛巾上放一层沾湿的滤纸，把浸泡结束的种子胚面向上整齐摆放在滤纸上，再在种子上面盖一层沾湿的滤纸，然后将毛巾盖在上面的滤纸上，写好标签；最后把装有准单倍体种子的发芽盘摆放在发芽室 （发芽室温度控制在28℃左右）精心管理适时适量喷水。

2.3 秋水仙素溶液配制

据研究证明，0.06%的秋水仙素浸泡胚芽加倍效果最佳。将配置秋水仙素溶液所需的Col、DMSO、量筒、烧杯、带封闭盖的大玻璃瓶放入通风橱内，戴上防毒面具和手套等防护措施并打开通风橱。量取一定体积的蒸馏水加入到大玻璃瓶中，量取总体积5%的DMSO 加入到烧杯中，将Col 粉末加入到烧杯中，待充分溶解后倒入大玻璃瓶中，用蒸馏水定容到所需的Col 溶液体积并封闭用力震荡5 min 使其充分混合；最后，把配制好的Col 溶液搬放到浸泡室备用。

2.4 准单倍体幼芽胚芽鞘尖端切除

从发芽室取出幼芽长度为2 cm 左右且尖端具有白色小泡的幼苗，根据紫色标记剔除生长势很强且胚根和膨大胚处为紫色的假单倍体幼苗，通常非单倍体幼苗的根和芽的长度是单倍体的2～3 倍。挑选出真的适合切除的单倍体幼苗，人工切去胚芽鞘尖端2 mm 左右，把不适合切除的幼苗再次放回到发芽室继续发芽，待幼芽长度达到要求后再进行切芽处理，尽可能的仔细切除后面幼苗的胚芽鞘尖端。

2.5 秋水仙素处理

把切除胚芽鞘尖端的幼苗小心的装入到小沙网袋中并做好标记，将小沙网袋放入浸泡桶内，戴好防护措施在浸泡室把配制好的Col 溶液倒入到浸泡桶内并密闭浸泡桶，将幼苗浸泡8 h。浸泡结束后取出小纱网袋放入干净的塑料盒或塑料桶内用流动的清水冲洗30 min 以上，待冲洗结束后取出小纱网袋。

2.6 药物处理后材料的处理

秋水仙素处理结束后，将幼苗移至育苗室或日光温室中。在塑料盒底部放置一条湿毛巾，把幼苗从小纱网袋中倒入塑料盒内，均匀铺开，上面再盖一条湿毛巾，定期喷洒蒸馏水，也可以给幼苗喷洒一定浓度的生长素，增强苗活力，给它提供良好的高磷培养环境促进根系的发育，待幼苗生根长出新的叶片时及时移栽。

3 田间管理

3.1 幼苗移栽

在幼苗药物处理之后，田间可以作业，采用大小垄膜下滴灌模式进行栽植。移栽前先覆好膜、滴足水，选择气温不要太高的晴朗天进行移栽，选择上午6：00开始和下午3：00 以后进行，避免中午高温对幼苗的伤害。将幼苗按20 cm 的株距进行栽植，幼苗露出地表1～2 cm，封严苗口，及时滴水，确保幼苗成活率。

3.2 田间精细管理

幼苗栽植后在田间有一定的缓苗期，这时一定要保证田间湿度。根据气温和田间土壤湿润程度及时浇水，防止幼苗失水而死。田间采用精细管理，及时除草、浇水、施肥、打药防虫等。

3.3 田间去除杂株和授粉

单倍体种子在加倍过程中常常不能全株被正常加倍，因此会表现出叶片狭窄且带有白色条纹、植株矮小、雌穗和叶序活力不够，在拔节期开始，陆续去除田间生长旺盛、叶片肥大的杂株。在雌穗吐丝前及时给雌穗套小袋，在雄穗散粉期仔细观察每一个单株的雄穗，看其能否正常散粉，一旦发现雄穗有散粉的情况，立刻授粉并挂牌。

4 注意事项

在准单倍体药物加倍进程和幼苗田间管理时，有许多需要注意的地方，这些细节有可能导致重大事故或加倍的失败，经过多年的试验，主要有以下几个方面。

4.1 准单倍体发芽期

发芽室的温度要控制在28℃左右，温度不能过高也不能过低，否则幼芽会徒长或生长缓慢，影响发芽质量；种子洒水不能太多，以保持毛巾湿润，水分饱和但托盘中没有积水为宜；发芽托盘、毛巾、滤纸需提前灭菌处理，以免种子在发芽过程中被感染。

4.2 准单倍体幼芽胚芽鞘切除期

准单倍体幼芽胚芽长度2 cm 为最佳切除时期，切除过早，秋水仙素对其伤害太大，致死率过高；切除过晚，膨大的芽会变成幼叶不能过行切割，也会在装纱网袋时容易造成断芽。

4.3 幼芽浸泡时期

由于秋水仙素剧毒，在配制0.06%秋水仙素溶液时，一定要做好防护。保证在穿戴防毒面具的同时尽可能地在通风橱中操作，如果没有通风橱，也要确保在空气流通顺畅的场地进行。配制好的秋水仙素溶液要密封在容器中备用，浸泡桶放入切好的幼芽，倒入配制好的秋水仙素溶液后也要密闭，并且放置在通风效果好的地方。

幼芽浸泡要严格控制在8 h，时间过短达不到加倍的效果，时间过长会加重秋水仙素对幼芽的毒害。浸泡后，用流水冲洗时，水量不宜过大，以免造成断芽，冲洗时间在30 min 以上即可，不可时间过长，以免影响幼芽活性。

4.4 幼芽田间移栽

经过秋水仙素处理的幼芽经过3 d 左右的活性恢复后，选择阴天或傍晚进行移栽，移栽后立即浇水，以免幼苗失水过多而死。移栽后的幼苗要进行精细管理，由于幼苗栽植只有1～2 cm，根据每天的气温和地表土壤干旱程度适时浇水，确保幼苗能够正常生根生长。

4.5 秋水仙素的保存与处理

根所每年秋水仙素的用量临时购置，不要一次性购置过多。秋水仙素购置后，检查密封是否完好，并严格的保存在冰箱或冰柜中，不可放置在室温下或暴露在空气中；在使用过程中如果秋水仙素不慎沾到皮肤上，必须立即用清水冲洗2 min 以上。用过的秋水仙素溶液不得随意倾倒，用密封的塑料桶装好放置在阴凉的角落，并做好标记，放置1 年以上待失去药性后方可倾倒。