利用酵母双杂交系统筛选绒毛白蜡FvCAMTA1互作蛋白

2021-12-28燕丽萍吴德军王因花高铖铖

中南林业科技大学学报 2021年12期

燕丽萍，吴德军，王因花，李丽，任飞，高铖铖

（1.山东省林业科学研究院山东省林木遗传改良重点实验室，山东济南 250014；2.山东农业大学林学院，山东泰安 271000）

钙离子（Ca2+）作为真核生物细胞中普遍存在的第二信使，作用于植物的生长发育和胁迫应答，其介导的信号转导对于由不同刺激引起的信号传输是至关重要的[1]，其中钙调素（calmodulin，CaM）是Ca2+感受蛋白的重要组成组分，CaM胞质中Ca2+信号是通过与下游CaM 结合蛋白（CaMBP）作用进而调节各种细胞反应[2]。目前，已有90 多个转录因子被鉴定为CaMBP 且分属于不同的蛋白家族，其中包括CAMTA、WRKY、MYB、CBP60、NAC、bZIP 和MADS-box 等家族[3]，作为Ca2+-CaM 的下游靶蛋白CAMTA，通过与Ca2+-CaM 结合来调节各种细胞反应，执行某些特定的生理功能，从而参与众多的生命活动过程，其中包括生物胁迫响应、非生物胁迫响应、通用胁迫响应、CAMTA参与调节植物的生长发育、CAMTA参与激素信号转导中的调节作用等生物过程。植物在遭受生物胁迫时，如在遭受病原体的侵害时，植物自身免疫反应和诱导性抗性都需要Ca2+梯度的参与，在拟南芥Arabidopsis thaliana中，CAMTA3功能缺失突变体能够自发诱导植物免疫反应。具体表现为植株矮化，褪绿病变，形成坏死斑，以及积累更高水平的H2O2[4]；水稻Oryza sativa与拟南芥AtCAMTA3 同源的OsCBT 功能缺失突变体虽然生长发育迟缓但对水稻黄单胞菌Xanthomonas oryzaepv.oryzae 和稻瘟菌Magnaporthe grisea的抗性增加，OsCBT 在生物胁迫中有着明显的负调控作用[5]；转录因子CAMTA在低温、盐害、干旱、金属毒害等非生物胁迫响应中有着重要的调控作用，Thomashow等[6]发现拟南芥在低温条件下，CAMTA3能够激活冷应答途径中的关键基因的表达，从而提高植物的抗寒性；在干旱以及盐胁迫下，CAMTA1突变体植株生长缓慢，拟南芥莲座叶皱缩，叶绿素含量下降，叶片呈现黄色甚至紫黑色，光系统II效率降低，水分利用效率降低，相对含水量下降，表明拟南芥CAMTA1参与植物对干旱以及盐胁迫的应答；拟南芥CAMTA2基因能够参与到调控植物抗铝毒过程中；Mitsuda 等[7]研究发现CAMTA参与到植物的花粉发育、果实成熟等生长发育过程中。

绒毛白蜡Fraxinus velutina既是开发利用盐碱地优先选择的乔木树种，也是优良的园林绿化树种[8]。由于其基因组较为复杂，基因组序列的测序和组装尚未完成，大大限制了对其功能基因的研究。Ca2+作为植物细胞重要的第二信使，参入多种植物胁迫的生物过程，并在逆境胁迫的信号转导中发挥重要作用，而Ca2+/CaM 信号调控的CAMTA 如何参与植物的盐胁迫应答还不清楚。本研究旨在通过以往构建的高质量的绒毛白蜡的均一化cDNA 文库，利用酵母双杂技术筛选与FvCAMTA1转录因子互作的蛋白，探究盐诱导的钙调素结合转录因子FvCAMTA1调控绒毛白蜡耐盐的分子机制，以期为进一步探讨绒毛白蜡抗盐分子调控网络提供依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

本课题组培育的耐盐绒毛白蜡‘盐蜡’新品种试管苗。酵母菌Y2HGold、酵母转化试剂盒、X-a-gal、Aba、Ade、SD/-Leu 培养基、SD/-Leu/-Trp 培养基、SD/-Leu/-Trp/-His 培养基、SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade 培养基、酵母双杂交载体质粒为pGBKT7、pGADT7 等购自Clontech。DH5α感受态细胞、总RNA 提取及凝胶回收大肠杆菌等试剂盒购自山东华博基因工程有限公司。DMSO购自默克集团西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司。TransStart FastPfu DNA Polymerase 购自全式金生物技术有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 盐胁迫后绒毛白蜡幼苗全株cDNA 文库构建

1.2.1.1 组织RNA 提取

选取生长2 周的6～8 叶试管苗，用150 mmol/L NaCl 处理12 h，冲洗干净，于干热灭菌后的研钵中加入液氮，研磨后利用山东华博基因工程有限公司研制的提取试剂提取RNA（具体方法参照说明书），采用分光光度计检测RNA 浓度和质量。

1.2.1.2 单链cDNA 合成

在无菌离心管中加入Total RNA 样品1 μg、CDSⅢ引物1 μL总体积为4 μL，72℃孵育2 min后，再冰浴2 min，14 000×g 离心10 s；配制如下溶液加入上述离心管中：5×First-Strand Buffer 2 μL、DTT(100 mM) 1 μL、dNTP Mix(10 mM) 1 μL、SMART MMLV Reverse Ttranscriptase 1 μL，总体积9 μL，42℃孵育10 min；加入1 μL SMART Ⅲ-modified oligo 混匀，42℃孵育1 h；75℃孵育10 min终止反应，冷却至室温后加入1 μL RNase H（2 Units），37℃温育20 min，-20℃保存。

1.2.1.3 双链cDNA 合成及纯化

LD-PCR 反应体系：First-Strand cDNA 2 μL、Deionized H2O 70 μL、10×Advantage 2PCR Buffer 10 μL、50×dNTP Mix 2 μL、5′PCR Primer 2 μL、3′PCR Primer 2 μL 10×Melting Solution 10 μL、50×Advantage 2 Polymerase Mix 2 μL，总体积100 μL；LD-PCR 反应条件为：95℃ 30 s，95℃ 10 s，65℃ 6 min，循环数20，68℃ 6 min，每个循环时间增加5 s；取7 μL 反应产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，余下部分进行纯化；颠倒混匀CHROMA SPIN TE-400 柱料，700×g 离心5 min，将余下PCR 产物（93 μL）加入柱料中；700×g 离心5 min，取液体加入1/10 体积3 M 醋酸钠和2.5 倍体积1/10 体积-20℃无水乙醇，-20℃冷冻1 h；14 000 rmp 离心20 min，去上清，沉淀干燥10 min；加入20 μL 去离子水溶解沉淀，然后取样进行琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.1.4 cDNA 与载体的连接及转化

使用同源重组的方式，将上述3 份7 μL的 cDNA 分别与3 μL 的经酶切处理线性化的pGADT7-Smal-1，pGADT7-Smal-2，pGADT7-Smal-3 载体混合，分别加入5 μL 的Infusion 重组酶，以及5 μL 的水，混匀。置于50℃反应1 h；加入2 μL 的 Proteinase K 灭活重组酶；加入78 μL无菌水到反应体系中，总体积达到100 μL；依次加入下列试剂：Glycogen (20 μg/μL) 1 μL、7.5 M NH4OAc 50 μL、100% ethanol 375 μL，混合均匀并置于-80℃不少于1 h，纯化收集cDNA；转化酵母感受态细胞Y2HGold，将转化子涂布于150 mm SD/-Leu 平板上，待菌落长到2～3 mm 时即收获转化子。

1.2.1.5 文库滴度检测

从获得的酵母双杂交文库中随机取出100 μL cDNA 文库菌液，分别稀释为10、103、106倍后涂布于90 mm SD/-Leu 平板上，30℃倒置培养3～5 d，分别统计平板上的菌落数以计算文库滴度。文库滴度(CFU=CFU/ml)=平板克隆数×稀释倍数/涂板体积。

1.2.2 诱饵载体的构建

前期根据绒毛白蜡盐胁迫转录组测序结果克隆了一个胁迫诱导表达基因FvCAMTA1的全长序列，设计带SfiI 酶切位点的特异性引物，其中上游引物为FvCAMTA-F-SfiI:5′-GGCCATGGAGGC CATGGAGACTAGCGAACCGG-3′）；下游引物为FvCAMTA-R-SfiI:5′-GGCCTCCATGGCCTTATC CCATGTTGATATCAGG-3′）。以绒毛白蜡cDNA为模板进行PCR 扩增，通过PCR 反应获得目的片段。PCR 反应体系50 μL 为：F（10 μM）1 μL、R（10 μM）1 μL、5×TransStart FastPfu Buffer10 μL、dNTP（2.5 μM）4 μL、TransStart FastPfu DNA Polymerase1 μL、模板cDNA 2 μL、ddH2O 31 μL。反应程序为：95℃预变性1 min；95℃变性20 s；54℃退火20 s；72℃延伸1.5 min；72℃后延伸5 min；35 个循环。采用2%的琼脂糖凝胶电泳检测，胶回收目的片段，对pGBKT7 载体进行SfiI单酶切，并胶回收线性化后的载体；参照试剂盒的操作方法，将目的片段和载体进行连接、采用热激法将10 μL 连接反应产物转入DH5a 感受态中转化、挑选有目的条带的单克隆进行摇菌提取质粒，对质粒进行测序并比对正确提取质粒，即为诱饵载体pGBKT7-FvCAMTA1。

1.2.3 诱饵载体的毒性及自激活检测

以阳性（pGBKT7-53+pGADT7-T）、阴性（pGBKT7 空载体）分别做对照，参照Clontech操作手册(Protocol No.PT40841)具体步骤，利用酵母转化法将诱饵载体pGBKT-7-FvCAMTA1和对照分别转化入酵母菌Y2HGold 感受态细胞中，涂SDO (SD/-Trp)板，30℃培养2～3 d 后，观察菌落生长情况。挑取长势优良的单菌落置于3 mL SD/-Trp 液体培养基摇菌管内，摇菌浓度OD 为1 h，按照梯度(原液，1∶10，1∶100，1∶1 000）稀释涂布于单缺SDO（SD/-Trp）和四缺QDO（SD/-Trp-Leu-His-Ade）固体培养基上，观察菌落生长情况，并判断诱饵蛋白是否具有毒性和自激活活性。

1.2.4 酵母cDNA 文库筛选

取5 mL SD/-Trp 诱饵菌液和1 mL cDNA 文库接种于45 mL2×YPDA 液体培养基，30℃50 rpm培养20 h，将菌液按200 μL/板涂布44 个150 mm SD/-Trp/-Leu/His 平板，30℃倒置培养3～5 d。将直径大于2 mm 的菌落全部转接至新的QDO/X/A平板上增大筛选压力，30℃倒置培养3 d。

1.2.5 FvCAMTA1 互作蛋白的分离筛选

挑取上述QDO/X/A 培养基中的阳性克隆扩大培养抽提 Prey 质粒，电转化至大肠杆菌感受态细胞（DH5a），涂布氨苄抗性LB 平板（含50 μg/mL Ampicillin）；挑选LB 平板上阳性克隆使用引物ADT7 和3’AD 进行菌落PCR，扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测；挑选鉴定正确的克隆扩大培养抽提质粒，即为分离出的插入cDNA 片段。

1.2.6 互作蛋白的测序及生物信息学分析

挑选与目的蛋白有相互作用的Prey 质粒送苏州金唯智生物科技有限公司进行测序，得到Prey蛋白基因序列。根据序列分析文库载体中插入的DNA 片段，利用NCBI 网站的Blast 功能预测目的基因进行序列同源性比对分析获得基因注释，利用GO 数据分析库注释基因功能。

1.2.7 互作蛋白酵母回转验证

进行转化酵母感受态细胞共转化验证，将质粒+ 重组诱饵载体、质粒+ 空诱饵载体、pGADT7-T+ pGBKT7-53、pGADT7-T+ pGBKT7-lam 组合转化酵母感受态细胞，涂布DDO 培养基，30℃倒置培养2～3 d，将直径大于2 mm 的菌落转接至DDO/X、QDO/X/A 平板上，30℃倒置培养3～5 d，回转酵母后再次显蓝的文库质粒可以保种用于今后的研究。

2 结果与分析

2.1 构建绒毛白蜡酵母双杂交cDNA 文库及鉴定

绒毛白蜡叶片总RNA 的D260 /D280=1.97，由图1可见，28S、18S 和5S 条带清晰，无弥散条带，表明RNA 提取质量好且未发生降解；RNA在00～500 bp 呈均匀弥散带(图1B)；ds cDNA长度分布在300～1 500 bp(图1C)，表明质量良好，符合后续建库要求。

图1 绒毛白蜡总RNA、mRNA 和ds cDNA 电泳图Fig.1 Agarose electrophoresis of Fraxinus velutina total RNA,mRNA and ds cDNA

经测定cDNA 文库滴度为4.58×109cfu/mL，符合酵母杂交文库构建的标准（图2）。随机挑取20 个酵母单克隆，采用 PCR 技术对其插入片段进行鉴定，结果表明（图3），扩增产物均有条带250～2 000 bp，重组率为100%。文库质量良好，可用于后续试验。

图2 文库滴度检Fig.2 Titer detection of libraries

图3 cDNA 文库鉴定PCR 产物凝胶电泳图Fig.3 PCR product gel electrophoresis map of cDNA library

2.2 克隆FvCAMTA1 基因及酵母双杂交诱饵载体构建

利用高保真酶TransStart FastPfu DNA Polymerase，PCR 扩增产物经2.0%琼脂糖凝胶电泳检测显示，条带大小约2 700 bp，符合预期片段大小要求(图4A)。将目的条带割胶回收后，用sfiI 对其及pGBKT-7 载体分别进行单酶切，电泳检测酶切完全后进行胶回收；利用T4DNA 连接酶将酶切后的FvCAMTA1连接到线性化的pGBKT-7 载体上，并转化大肠杆菌DH5a，然后利用引物F 和R 对菌落进行PCR 鉴定(图4B)。挑选符合预期片段大小阳性克隆菌提取质粒、测序。测序结果表明，插入目的片段与FvCAMTA1基因的阅读框序列是完全一致。说明已成功克隆了FvCAMTA1基因并构建了酵母诱饵质粒pGBKT-7-FvCAMTA1。

图4 酵母双杂交诱饵载体 pGBKT-7-FvCAMTA1 的构建Fig 4 Construction of bait vector pGBKT-7-FvCAMTA1

2.3 pGBKT-7-FvCAMTA1 诱饵载体毒性及自激活分析

将诱饵载体pGBKT-7-FvCAMTA1 和空载体pGBKT-7 分别转化入酵母菌Y2HGold 感受态细胞中，涂SDO（SD/-Trp）板，30℃培养2～3 d 后，两者都能够正常长出白色菌落，单克隆数量大致相近，且菌落直径大于2 mm，生长速度也无明显差异(图5)，表明pGBKT-7-FvCAMTA1 对Y2HGold 无毒性作用。但在QDO（SD/-Trp-Leu-His-Ade）四缺培养基上，只有阳性对照可以长出白色菌落，而阴性对照及转化诱饵质粒的都未长出。为了更直观地反映结果，我们收集3 者SDO培养基上的克隆，将原液以及分别稀释为10、100、1 000 倍的菌液，接种到同一块SDO 或QDO培养基平板上进行菌落生长情况比较（图6），可见诱饵载体无毒性且无自激活能力。

图5 诱饵载体在酵母中的毒性检测Fig.5 Toxicity detection of recombinant bait vector in yeast cells

图6 诱饵载体自激活分析Fig.6 Analysis of tself-activation of bait vector

2.4 酵母双杂交筛选pGBKT-7-FvCAMTA1 的互作蛋白

将诱饵质粒与cDNA 文库混合进行杂交转化后，涂布于三缺培养基SD/-Trp/-Leu/His 上进行酵母双杂筛选；将直径大于2 mm 且生长健康的单菌落全部转接至增大筛选压力20 mg/L 浓度Aba 的QDO/X/A 平板上，30℃倒置培养3 d，共获得54个酵母单克隆（图7）。将筛选出的阳性克隆提取酵母质粒，并用ADT7 和3’AD 通用引物进行PCR 检测，PCR 鉴定结果显示最终得到46 个PCR检测为400～1 500 bp 的阳性克隆(图8)；将检测出有条带的酵母质粒转化到大肠杆菌中；对转化后的大肠杆菌使用引物ADT7 和3’AD 进行菌落PCR，挑选鉴定正确的克隆扩大培养抽提质粒；将抽提出的Prey 质粒与诱饵载体共转化酵母感受态细胞，涂布于SD/-Leu/-Trp 平板上，30℃倒置培养3 d，将筛选出的部分阳性克隆分别回转至SD/-Leu/-Trp/X，SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade/Aba/X 平板上，选取能够在SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade/Aba/X 平板上正常生长，颜色为蓝色的菌落对应质粒，使用引物ADT7 进行测序，测序后进行NCBI 数据库中BLAST 比对和分析。

图7 QDO/X/A 平板上的阳性克隆Fig.7 Positive clones on QDO/X/A plate

图8 酵母双杂交筛选验证Fig.8 Confirmation of yeast positive interactions

2.5 相互作用的诱饵质粒测序分析

由表1比对分析结果，筛选获得46 个可能与FvCAMTA1 互作的蛋白质，主要有生长发育、转录因子、代谢过程中重要的酶和一些功能未知蛋白。46 个蛋白比对到2 个物种，即木樨榄Oleaeuropaeavar.sylvestris 与芝麻Sesamum indicum，其中比对到木樨榄的注释基因最多，有45 个，比对到芝麻的注释基因只有1 个。在Uniprot 在线网站上，对候选46 个互作蛋白进行了Gene Ontology（GO）注释（图9），结果表明有11 种FvCAMTA1 的候选互作蛋白参与生物过程，包括生物调节、发育过程、生长和刺激的响应等；参与细胞组分有12 种，包含细胞膜、细胞器、共质体等；有7 种参与分子功能调控，包括抗氧化活性、蛋白结合、分子调节和转录调控活性等活性。

图9 FvCAMTA1 候选互作蛋白的Gene ontology 注释Fig.9 Gene ontology annotation of the FvCAMTA1candidate interaction protein

表1 FvCAMTA1 互作蛋白及同源物种Table 1 FvCAMTA1interaction proteins and homologous species

其中，筛选出的蛋白是否与FvCAMTA1 互作并共同调控基因表达，由于酵母双杂交存在一定的假阳性，还需要结合双分子荧光互补(BiFC)试验、免疫共沉淀等技术来验证蛋白相互作用，深入研究筛选出的互作蛋白如何与FvCAMTA1 共同调控耐盐机理。

2.6 互作蛋白的酵母回转验证

为进一步验证与靶蛋白的相互作用，将筛选获得的46 个cDNA 序列部分转化含有pGBKT7 或pGBKT7-FvCAMTA1 转化子的酵母感受态中，进行回转验证。结果显示转化液在SD/-Trp-Leu 培养基上均能正常生长，而在QDO/X-α-Gal 培养基上的生长存在一定差异。本研究以重点分析的5号和9 号耐盐抗旱基因候选序列，回复验证结果见图10，在QDO/X-α-Gal 培养基上阳性对照和pGBKT7 载体+5（9）号菌落呈蓝色。表明二者在酵母体内能够发生相互作用，酵母回转实验进一步验证了阳性克隆的正确性，排除了假阳性的干扰。

图10 FvCAMTA1 与部分候选蛋白体外互作的回补验证Fig.10 Interaction validation of FvCAMTA1 and partial candidate proteins in vitro

3 讨论

利用酵母双杂交系统筛选互作蛋白必须构建高质量cDNA 文库。本实验构建的cDNA 文库滴度为4.58×109 cfu/Ml，达到了文库筛选的要求。通过构建的cDNA 文库，筛选得到46 个与诱饵蛋白FvCAMTA1 互作的蛋白质，为进一步研究FvCAMTA1 的分子机制提供了基础。

在筛选的46 个与FvCAMTA1 发生互作的蛋白质中，有蛋白NRT1/PTR 家族6.4、WRKY7 转录因子、糖体蛋白、金属硫蛋白、早期光诱导蛋白等，还有部分未知蛋白。其中含有的WRKY7转录因子属于WRKY基因家族，广泛参与植物的胁迫响应与生长发育过程，研究发现在拟南芥中AtWRKY的超表达可提高其对灰霉病和黑斑病的抗性[9]，水稻OsWRKY13和OsWRKY31的过表达则能增强其对稻瘟菌的抗性[10-11]。FvCAMTA1与WRKY7相互作用，可能是与WRKY7共同调节参与植物的免疫应答响应。糖体蛋白是细胞中参与蛋白质合成及调控基因表达的一种重要蛋白，其中构成核糖体的重要组成部分为40S 核糖体，对核糖体转录效率的高低以及稳定性方面具有重要影响。在细胞核中由核糖体蛋白S6 组装成的前体，位于细胞质40S 核糖体亚单元头部区域，为真核生物核糖体主要磷酸化蛋白，在拟南芥中，核糖体蛋白S6 随着热激反应，磷酸化状态改变[12]。

在互作蛋白中也发现有硝酸盐转运蛋白NRT1/PTR 家族蛋白，在拟南芥中硝酸盐转运蛋白基因NRT1.3（AtNPF6.4）的突变增加了对多胺抗性，参与植物的黄化过程[13]。江鑫豪等[14]发现紫花苜蓿Medicago sativa根中随着氮素的添加硝酸盐转运蛋白基因NRT1.3 的表达量显著增加，NRT1.3基因的表达与紫花苜蓿的株高、鲜重及叶绿素、硝酸盐含量也呈显著正相关关系；硒蛋白K（SelK）是一种11 kda 硒蛋白，在人体内可能参与氧化应激、内质网应激和免疫应答的调节。SelK 可能通过调节CHERP 释放Ca2+，刺激T 细胞增殖分化中发挥重要作用；生育酚环化酶是植物维生素E（又名生育酚）生物合成途径的关键酶之一，研究表明，生育酚环化酶能够通过提高的α-生育酚含量和降低脂质过氧化水平，从而提高植物对干旱胁迫的耐受能力。大量的证据表明生育酚含量参与植物对低温、干旱、盐胁迫响应[15-16]；研究表明5’-甲硫腺苷/S-腺苷同型半胱氨酸核苷酶参与到很多的免疫反应中；在逆境环境中，部分糖基转移酶会被诱导高表达，而部分糖基转移酶的表达下降会导致植物的抗病菌能力下降[17]；金属硫蛋白是分子量小、富含半胱氨酸的多肽，研究表明金属硫蛋白可以结合Cd、Zn 和Cu 等金属离子，小麦Triticum aestivum和水稻的MT 基因可以被多种金属离子（例如Cu，Cd 和 Al）和非生物胁迫（如高温）诱导[18]，豌豆（Ps MTa）金属硫蛋白在大肠杆菌中表达后可以结合Cd，Zn 和 Cu[19]；早期光诱导蛋白（ELIP）是核基因编码的叶绿体类囊体膜蛋白，许多研究结果表明，ELIP 基因在植物处于光合作用活性受到抑制的环境条件下被诱导表达，但是，其 mRNA 和蛋白在光胁迫下保持高水平，反之则迅速降[20]。在拟南芥的突变体中，由于不能积累ELIP，在低温和高光胁迫下，植物会收到损伤，由此推测ELIP 在植物受到光胁迫时发挥着光保护作用[21]；对于蛋白CROWDED NUCLEI（CRWN），研究表明，在拟南芥中该蛋白参与了ABA 对种子萌发的调控；叶绿素a/b 结合蛋白Cab 是一类色素蛋白，是由色素和色素结合蛋白结合而成，能捕获光能，把光能转化成电能并迅速传至光反应中心引起光化学反应，它们利用核基因编码，参与光能的捕获、能量的传递以及各种胁迫应答，如病原体侵染、低温、干旱等胁迫[22]。

双性螺旋蛋白Sin3-like 可能参与ABA 和乙烯途径调控种子休眠途径[22]；异极性树脂醇脱氢酶参与植物防御[24]；蛋白磷酸酶2C 参与ABA 信号途径，被认为是ABA 的共受体[25]；主要过敏原Pru-ar 1 可以在生物与非生物诱导下产生，该蛋白具有RNAase 活性，对大豆疫霉菌菌丝生长有抑制作用，也抑制游动孢子的释放。蛋白的过表达，表现为对大豆疫霉的抗性增强。这些结果表明，主要过敏原蛋白蛋白在大豆抗大豆疫病菌侵染中起着重要的防御作用[26]；病原体相关蛋白，该蛋白在植物生物胁迫下有表达，如病原体或者茉莉酸诱导在，也可以在非生物胁迫下有表达，如衰老和损伤，因此，它可能抵抗植物的生物与非生物胁迫[27]；二磷酸核酮糖羧化酶是影响CO2固定的关键酶，在植物光合作用中起重要作用，影响植物的净光合速率，进而影响植物的生产量[28]。

酵母双杂交筛库技术是确定蛋白与蛋白相互作用的关键技术之一，酵母双杂交系统能在体内测定蛋白质的结合作用，具有高度敏感性。但是由于蛋白质的表面可能存在一些低亲和力的区域，一些蛋白会在这些区域与目的蛋白发生相互作用形成结构稳定的复合物，并产生毒性作用，从而阻止融合细胞进入到细胞核内，这样可能会影响报告基因的表达，因此酵母双杂系统存在一定的假阳性。为确定这些蛋白与FvCAMTA1 互作的真实性，在下一步研究中需要使用免疫共沉淀或双分子荧光互补等试验来进行验证，并通过相互作用的蛋白进一步研究FvCAMTA1的调控机制及生物学通路。