不同栽培年限人参根区土壤养分酶活性及微生物量的变化

王天佑，丁万隆，尹春梅，王蓉，李勇*

1.中国医学科学院 北京协和医学院 药用植物研究所，北京 100193；

2.吉林农业大学 中药材学院，吉林 长春 130118

人参Panax ginsengC.A.Meyer 为五加科多年生宿根草本植物，以干燥根和根茎入药，是驰名中外的补益类中药材，具有大补元气、复脉固脱、补脾益肺、生津养血、安神益智等功效[1]。但人参具有极强的忌连作特性，老参地通常数十年内无法重复栽参[2]，即使通过撂荒、轮作等传统模式加以改良也难以恢复到初始水平[3]。历史上“伐林栽参”模式虽一定程度上缓解了人参市场的供需矛盾，却引发土壤肥力下降、水土流失、生物多样性减退等诸多生态问题[4]。深入研究人参连作障碍形成机制、加快老参地循环再利用，不仅能促进中药材生产与自然生态环境和谐发展，还有助于推动人参种植模式优化升级。

已有研究发现，连作导致人参根区土壤营养失衡，根系有机酸分泌量显著增加，最终表现为土壤微生物群落结构、酶活性及理化性状等的变化[5]。本研究通过对我国人参主产区不同栽培年限人参根区土壤pH、养分含量、酶活性及菌群动态的测定，进而分析人参栽培过程中不同土壤因子的动态变化及其相互联系，为阐明人参连作障碍形成机制提供参考。

1 材料

1.1 试药

牛肉膏、蛋白胨、虎红、链霉素、葡萄糖、琼脂、蔗糖购自奥博星生物技术有限公司；其他试剂均为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器

SPX-150 型生化培养箱（中仪国科科技有限公司）；UV-2450 型紫外分光光度计（岛津仪器有限公司）；万分之一天平（上海精密科学仪器有限公司）；Scout pro 型电子天平（奥豪斯电子天平仪器上海有限公司）；ZHWY-100H 型恒温培养振荡器（上海智城分析仪器制造有限公司）；DH-8D 型水浴锅（上海一恒科技有限公司）；BSC型生物安全柜（北京东联哈尔仪器制造有限公司）；LX-B35L型立式自动电热压力蒸汽灭菌器（合肥华泰医疗设备有限公司）。

1.3 样品

2～5 年生栽参农田土（编号为FSG2～FSG5）及对照农田土（FSFL）采自吉林省抚松县北岗镇（N42°26′55″，E127°34′41″），平均海拔836 m，气压91.68 kPa。全部土壤样本采用五点法[6]取样，每个样点随机选取6 株健康生长的人参，小心挖出人参根并收集根围土（与主根距离<5 cm）。将土壤中的石块、植物残体、杂草等剔除干净，分别装入无菌自封袋，记录对应的人参生长年限。

2 方法

2.1 前处理

样品加冰袋带回实验室，立即过2 mm筛，部分用于土壤微生物分析，剩余室温风干后用于土壤酶活性及营养元素分析。

2.2 土壤酶活性测定

土壤脲酶、酸性磷酸酶、纤维素酶和蔗糖酶活性均采用比色法[7]测定；土壤过氧化氢酶活性采用改良紫外-可见分光光度法测定[8-9]。

2.3 土壤养分测定

土壤pH 测定参照NY/T 1377—2007[10]；土壤有机质测定参照NY/T 1121.6—2006[11]；土壤总氮及总碳测定采用高温燃烧法[12]；土壤全磷及全钾测定采用电感耦合等离子体（ICP）定量法[13]；土壤碱解氮测定参照LY/T 1228—2015[14]；土壤有效磷测定参照NY/T 1121.25—2012[15]；土壤速效钾测定参照NY/T 889—2004[16]。

2.4 土壤微生物

土壤微生物量采用平板稀释计数法[17]测定。牛肉膏蛋白胨培养基培养细菌、高氏一号合成培养基培养放线菌、马丁-孟加拉红-链霉素培养基培养真菌。细菌、放线菌30～300 个菌落/皿，真菌10～100个菌落/皿为宜。接菌后28 ℃恒温培养（细菌1～2 d、放线菌3～4 d、真菌3～6 d），按公式（1）计算微生物原始浓度。

2.5 数据分析

利用Excel 2016、SPSS 20.0 和GraphPad Prism 8.0.2 软件进行数据处理、统计分析及作图；单因素方差分析（ANOVA）比较不同处理间土壤因子的显著性差异；Pearson 相关分析推测土壤因子间的相互关系；按公式（2）～（5）计算土壤酶活性相对指数、土壤酶活性综合指数、土壤微生物丰富度指数及土壤微生物丰富度综合指数[18]。

3 结果与分析

3.1 土壤养分分析

本研究中土壤整体偏酸性（pH 4.5～4.7），非栽参农田土壤（pH 4.7）相较于栽参农田土壤略有改观，但仍未达到人参最适生长pH（pH 5.5～6.5）。随连作年限增加，土壤pH 差异无统计学意义；非栽参农田土壤pH 与栽参5 年土壤差异无统计学意义，与其他年生人参栽培土壤差异有统计学意义（P<0.05）；土壤碱解氮和速效钾含量随人参栽培年限增加在土壤中逐渐积累，且不同年限间差异有统计学意义（P<0.05）；土壤有效磷呈先上升后降低趋势，在人参栽种4 年后达到峰值（169.5 mg·kg-1），5 年后骤降至88.7 mg·kg-1；土壤有机质随栽培年限增加呈先缓慢降低后升高趋势，栽种4 年后最低（46.4 mg·kg-1），5 年后最高（60.7 mg·kg-1）；土壤碳氮比（C/N）随人参种植年限增加呈先降低后升高趋势；土壤全磷和全钾含量随栽培年限增加，呈先上升后降低再上升趋势（表1）。

表1 栽参及对照土壤养分分布

3.2 土壤酶活性分析

土壤酶活性综合指数由大到小依次为对照农田土、3 年生农田土、4 年生农田土、5 年生农田土、2 年生农田土。随人参栽培年限增加，土壤酶活性总体呈先上升后下降的趋势，非栽参土壤相较于老参地土壤酶活性更高（表2）。

表2 栽参及对照土壤酶活性指数

3.2.1 脲酶活性 研究发现，不同栽培年限人参根区土壤脲酶活性差异有统计学意义（P<0.05）。随人参栽培年限增加，土壤脲酶活性呈先下降后升高趋势，大致呈V 型。对照农田土壤脲酶活性最高（42.46 mg·g-1），3 年生人参根区土壤脲酶活性最低（9.37 mg·g-1），见图1。

图1 栽参及对照土壤脲酶活性（,n=3）

3.2.2 酸性磷酸酶活性 土壤酸性磷酸酶活性随人参栽培年限增加呈逐渐上升趋势（图2），不同栽培年限人参根区土壤间差异有统计学意义（P<0.05）。其中，5 年生人参根区土酸性磷酸酶活性最高（160.33 mg·kg-1）；2 年生人参根区土酸性磷酸酶活性最低（97.552 mg·kg-1）。

图2 栽参及对照土壤酸性磷酸酶活性（,n=3）

3.2.3 纤维素酶活性 随栽培年限增加，土壤纤维素酶活性大致呈倒V 型变化趋势（图3）。2 年生人参根区土壤纤维素酶活性与对照土壤差异无统计学意义，其余土壤样本差异有统计学意义（P<0.05）。其中，3 年生人参根区土壤纤维素酶活性最高（1.487 mg·kg-1），5 年生人参根区土壤纤维素酶活性最低（0.195 mg·kg-1）。

图3 栽参及对照土壤纤维素酶活性（,n=3）

3.2.4 蔗糖酶活性 土壤蔗糖酶活性随人参栽培年限增加大致呈倒V 型变化趋势（图4），不同栽培年限人参根区土壤间无统计学意义。对照土壤蔗糖酶活性最高（0.87 mg·kg-1），其次是3 年生人参根区土壤（蔗糖酶活性为0.72 mg·kg-1），2 年生人参根区土壤蔗糖酶活性最低（0.44 mg·kg-1）。

图4 栽参及对照土壤蔗糖酶活性（,n=3）

3.2.5 过氧化氢酶活性 土壤过氧化氢酶活性随栽培年限增加呈N 型变化趋势（图5）。其中2 年生和5 年生人参根区土壤过氧化氢酶活性无统计学意义，其余土壤样本过氧化氢酶活性差异有统计学意义（P<0.05）。连作3 年人参根区土壤过氧化氢酶活性（0.972 mg·kg-1）显著高于其他土壤样本；4 年生人参根区土壤过氧化氢酶活性最低（0.203 mg·kg-1）。

图5 栽参及对照土壤过氧化氢酶活性（,n=3）

3.3 土壤微生物量分析

由不同土壤样本3 类微生物的统计结果（表3）可知，在对照土壤中细菌生物量显著高于真菌及放线菌；4年生和5年生人参根区土壤真菌生物量显著低于对照组（P<0.05），2 年生和3 年生人参根区土壤真菌生物量显著高于对照组（P<0.05）；不同年生人参根区土壤细菌生物量均显著低于对照组（P<0.05）；4 年生和5 年生人参根区土壤放线菌生物量显著低于对照组（P<0.05），3 年生人参根区土壤放线菌生物量显著高于对照组（P<0.05），2 年生人参根区土壤放线菌生物量与对照组差异无统计学意义。

表3 栽参及对照土壤微生物种类及生物量（, n=3）

表3 栽参及对照土壤微生物种类及生物量（, n=3）

研究发现，供试土壤微生物丰富度综合指数由大到小依次为3年生农田土、非栽参农田土、2年生农田土、4年生农田土和5年生农田土（表4）。整体微生物丰富度随人参栽培年限增加呈先上升后下降趋势，非栽参土壤微生物丰富度相较于栽参土壤整体水平更高。

表4 栽参及对照土壤微生物丰富度指数

3.4 土壤因子相关性分析

如表5 所示，相关系数（r）≥0.2 的数据占全部数据的80.88%。其中，土壤pH 与土壤有机质呈显著正相关（P<0.05），与全磷含量及脲酶活性呈极显著正相关（P<0.01）；土壤有机质含量与土壤纤维素酶活性呈显著负相关（P<0.05）；土壤C/N 与土壤全钾含量呈极显著负相关（P<0.01），与真菌和放线菌生物量呈显著负相关（P<0.05）；土壤全磷含量与土壤脲酶活性呈显著正相关（P<0.05）；土壤全钾含量与土壤过氧化氢酶活性呈显著正相关（P<0.05），与土壤放线菌生物量呈极显著正相关（P<0.01）；土壤速效钾含量与土壤脲酶活性呈显著负相关（P<0.05），与土壤细菌生物量呈极显著负相关（P<0.01）；土壤酸性磷酸酶活性与土壤真菌生物量呈极显著负相关（P<0.01）；土壤过氧化氢酶活性与土壤放线菌生物量呈极显著正相关（P<0.01）。

表5 栽参土壤因子皮尔森相关分析

4 讨论

研究表明，土壤酸化会引发肥力下降、营养元素流失、重金属积累、微生物群落结构失衡等问题，这是土壤退化的一个重要表现[19]。本研究发现，全部供试土壤均偏酸（pH 4.5～4.7），这与前人报道基本符合[20]。土壤总碳及土壤有机质作为土壤肥力水平的重要指标，与植物生长及生态环境密切相关。随人参栽培年限增加，土壤有机质及总碳量逐年降低，直接影响土壤养分供给，加剧人参连作障碍，这与孙海[21]报道一致。氮、磷、钾在土壤中的浓度高低及存在形式对植物生长具有重要意义。本研究中土壤总氮及碱解氮随栽培年限增加，均呈现先升高后降低再升高的趋势，说明其在土壤中的转化与消耗速率接近，总体水平相对稳定；土壤全磷和全钾与总氮变化趋势一致，但有效磷呈现先升高后降低趋势，速效钾呈逐渐升高趋势，且这2 种有效成分含量与非栽参农田土壤相差较大，表明在人参种植初期，土壤中初始的磷素便能满足人参生长初期的消耗，同时钾的增多显示为了保证栽参土壤具有良好的渗透势以及促进土壤酶系统的活化，试验地实施了合理有效的人参种植管理方案。

一般来说，4～5 年生人参正处于生长旺盛时期，对养分需求会比较大，5 年生根区土壤中的养分含量应该低于4 年生人参根区土壤，然而实际检测发现，5年生人参根区土壤养分反而较4年生人参出现小幅上升，推测与收获年份为保证人参产量而采取的人为水肥干预有关。

本研究对试验地块进行了严格的肥药管理，即对该地块实施集免疫调节、促生拮抗、生物刺激、杀菌剂及植物营养类剂于一体的、有效的肥药调控以保持土壤的养分供给。多数肥药剂量以每75 m2施用1 单位体积（瓶、袋）为基准（健达、哈茨木霉和荣亚每3 m2施用1 单位体积）；所有药剂均按照使用说明溶解，并以喷灌的方式施用。3～5 年生人参肥药管理方案与1～2 年生不同，除池面消毒外，1～2 年生各进行9 次肥药喷灌，而3～5 年生进行10 次，且肥药配方中3～5 年生使用了更多的杀菌剂和促生拮抗剂，导致各营养水平最终呈现不同程度的上升趋势。

土壤矿质元素及其形态类型是土壤质量的核心，其与土壤酶活性及土壤微生物组成紧密相关。本研究发现，人参根区土壤纤维素酶、蔗糖酶、过氧化氢酶活性均呈倒V 形变化，这与张亚玉等[22]的报道一致。相关性分析发现，土壤脲酶活性与土壤碱解氮含量正相关；土壤酸性磷酸酶活性与土壤有效磷含量正相关；纤维素酶活性与土壤有机质显著负相关。上述结果说明，土壤酶对土壤养分转化及供给的正向作用，且土壤脲酶、酸性磷酸酶以及纤维素酶活性的变化趋势与碱解氮、有效磷及有机质含量的变化趋势相对应，从侧面印证了土壤酶在矿质元素转化中的重要作用。

土壤微生物是养分转化的源和库，其在土壤矿质元素转化及养分供给中扮演重要角色。本研究发现，随着人参栽植年限的增加，人参根区土壤真菌、细菌及放线菌丰富度指数均不断降低，微生物种群趋于单一化，这与前人的研究结果一致[23-24]。分析发现，r≥0.2 的数据占全部数据的80.88%。上述研究结果表明，土壤微生物、矿质元素及酶活性等因子间关系非常复杂，人参栽培过程中土壤微生态失衡以及病原物含量的增加，是人参连作障碍形成的主要原因之一。