新疆阿魏内生真菌链格孢属菌提取物体外抑制肿瘤增殖活性筛选△

赵亚琴，徐倞倞，李晓瑾*，樊丛照，朱军，王果平

1.新疆维吾尔自治区中药民族药研究所，新疆 乌鲁木齐 830002；

2.国家中医药管理局 新疆中药民族药资源重点研究室，新疆 乌鲁木齐 830002；

3.新疆农业大学，新疆 乌鲁木齐 830052

阿魏应用历史悠久，为汉族、维吾尔族、蒙古族、藏族等各民族传统医用药之一。现代药理学研究表明，阿魏具有抗生育、免疫抑制、解热、镇痛、抗炎、抗肿瘤等广泛的药理活性，近年来因发现其具有植物雌激素活性成分和抗癌活性物质而备受关注[1]。新疆阿魏Ferula sinkiangensisK.M.Shen 是仅产于新疆的道地药材，具有多年生早春短命植物特性，日益增长的市场需求致使该物种濒临灭绝[2]，因此寻找新疆阿魏替代资源具有重要意义。

植物内生真菌（endophytic fungi）是指部分或者全部时期生活在植物体内，而不会引起宿主植物产生明显病害症状的一类真菌，在与宿主植物共生的漫长过程中与宿主植物建立起了互利互惠的关系。其种类丰富，次级代谢活跃，不仅能产生一些结构独特、骨架新颖的活性化合物，而且这类化合物生物活性较强[3]。多项研究表明，植物内生菌代谢产物含有与宿主植物相同或相似的有效成分，从内生真菌分离得到的活性物质中有50%以上是新化合物且抗癌活性显著，为临床应用提供了新的药物来源[4]。

基于植物内生真菌能够产生与宿主相同或相似的活性成分，本研究对前期已分离获得的117株新疆阿魏内生真菌提取物进行抗肿瘤活性体外筛选与评价，以期寻找具有产生抗肿瘤活性物质潜力的菌株，对挖掘和拓宽阿魏资源及新型抗癌活性物质的研究提供参考。

1 材料

1.1 菌株

117 株菌种源自伞形科植物新疆阿魏Ferula sinkiangensisK.M.Shen 的内生真菌，保藏于新疆中药民族药研究所实验室菌种库，由于菌株保密原因，其名称尚未公开。

1.2 细胞

人宫颈癌HeLa 细胞和胃癌AGS 细胞均由中国医学科学院药用植物研究所天然药物研究中心化学室主任斯建勇教授惠赠，由实验室传代保存。其中，HeLa 细胞使用DMEM 培养基培养，AGS 细胞使用Ham′s F12培养基培养。

1.3 试药与仪器

马铃薯葡萄糖（PDA）培养基（批号：P8931，北京索莱宝科技有限公司）；高糖DMEM 培养基（批号：12100-046，美国Invitrogen 公司）；Ham′s F12 培养基（批号：SH30026.01B，美国Hyclone 公司）；胎牛血清（批号：70220-8611，浙江天杭生物科技有限公司）；胰蛋白酶和青链霉素混合物（批号：25200-056，美国Gibco 公司）；二甲基亚砜（DMSO，批号：0231，美国Amresco 公司）；磷酸盐缓冲液（PBS，批号：P1022，北京索莱宝科技有限公司）；四甲基偶氮唑盐（MTT，批号：298-93-1，美国Sigma 公司）；SA-1500-1 型（SHJ 系列）超净工作台（上海上净净化设备有限公司）；Sorvall legend Micro 17 型高速离心机、Fomia-86C991 型低温冰箱（美国Thermo 公司）；CKX41SF 型倒置光学显微镜（日本Olympus 公司）；JJ200 型电子分析天平（上海精科仪器有限公司）；MLS-3750 型全自动高压灭菌锅（日本Sanyo 公司）；MQX200 型酶标仪（美国BioTek 公司）；QL-901 型96 孔培养板（美国Corning公司）。

2 方法

2.1 冻存菌株的复苏纯化与发酵粗提取

将本课题组前期分离鉴定的内生真菌菌株活化，利用PDA 培养基培养，获得供试内生真菌提取物[5]。菌株接入培养基中，于25 ℃、180 r·min-1摇床振荡培养15 d；滤过，分别收集培养液与菌丝体；培养液旋蒸后得到浸膏，编号为1～117；菌丝体用甲醇回流提取，旋蒸，回收甲醇，得到菌丝体醇提浸膏117 份，编号为118～224（10 份菌丝体浸膏难以溶解未编入受试样品，菌株编号为2661/6852、2694/7253、2604/7251、2692/6826、2645/7250、2582/6614、2692/6836、2633/6835、501/3340、2584/6636）。

2.2 供试品制备

供试母液用DMSO 配制，分别称取供试品（含菌丝体提取物、培养液体提取物）500 μg 于离心管中，加DMSO 500 μL，超声助溶后置于4 ℃冰箱备用。

2.3 MTT法检测提取物抗肿瘤活性

2.3.1 提取物对HeLa、AGS细胞增殖的影响 HeLa、AGS细胞以5×104个/mL接种于96孔板，每孔100 μL，置于37 ℃、5%CO2培养箱中培养24 h 至长满单层。加入终质量浓度为100 μg·mL-1受试样品100 μL[6-7]，每个样品设3 个复孔，设置调零孔（只加培养基）、溶剂对照组（加入终体积分数为0.1%的DMSO）。培养48 h 后，加MTT（5 mg·mL-1）溶液20 μL 避光孵育4 h，弃去，每孔加DMSO 150 μL 振荡溶解，490 nm 波长条件下测吸光度（A）值，计算每个样品3 个复孔A值的平均值，按公式（1）计算不同质量浓度提取物对HeLa、AGS 细胞的增殖抑制率（IR）。

2.3.2 有效样品的半数抑制浓度（IC50）测定 以抑制率>50%为标准，筛选具有明显的肿瘤细胞增殖抑制活性的提取物，采用MTT 法（受试样品质量浓度从200 μg·mL-1起，2倍比稀释供试提取物）测定有效样品的IC50。

2.4 数据分析

采用SPSS 25.0 统计分析软件的t检验进行数据分析，计量数据用（）表示。

3 结果

3.1 新疆阿魏内生真菌提取物对HeLa、AGS 细胞增殖的影响

结果表明，在质量浓度为100 μg·mL-1时，以抑制率大于50%为标准，得到有抑制肿瘤细胞增殖活性的样品49 份（表1），占受试菌株的36.7%。其中菌液提取物12 份、菌丝体提取物37 份；有6 株菌（编号分别为2618/6821、2596/6643、465/N190、2571/6657、487/3322、439/N158）的菌液提取物及菌丝体提取物对肿瘤细胞的增殖均具有显著抑制作用；15 份样品对2 种细胞均具有明显的抑制作用（图1）。

图1 15个新疆阿魏内生真菌提取物对AGS和HeLa细胞增殖的抑制率（,n=3）

表1 阿魏内生真菌提取物对2种肿瘤细胞增殖的影响

3.2 有效样品的IC50测定结果

结果显示，1938/TL168号菌株对HeLa细胞抑制作用最强，IC50为（25.95±3.39）μg·mL-1；2682/6626号菌株提取物次之，IC50为（30.53±2.84）μg·mL-1。对AGS 细胞抑制作用最强的是2690/7242 号菌株，IC50为（32.17±2.47）μg·mL-1（表2）。

表2 新疆阿魏内生真菌提取物对AGS和HeLa细胞的IC50（,n=3）μg·mL-1

表2 新疆阿魏内生真菌提取物对AGS和HeLa细胞的IC50（,n=3）μg·mL-1

4 讨论

4.1 新疆阿魏内生真菌具备开发为抗肿瘤新药的潜质

植物内生真菌通过与植物交换基因，可以产生与宿主相同或相似的化合物，现已成为天然活性物质的重要资源库之一[8]。本团队前期对新疆阿魏不同部位提取物进行体外抗肿瘤活性研究，发现新疆阿魏树胶和种子的脂溶性部分对人胃癌、宫颈癌等细胞增殖具有显著的抑制作用[9-10]。本研究发现，新疆阿魏内生真菌可有效抑制胃癌、宫颈癌等癌细胞的体外增殖，亦证实了内生真菌可以产生与其宿主相关的活性物质。《国家新药（西药）临床前研究指导原则汇编》规定，体外抗肿瘤效果的评价以体外IC50表示，当植物提取物对肿瘤细胞增殖的IC50≤30 μg·mL-1，即被认为体外具有抗肿瘤活性[11]，新疆阿魏内生真菌编号为1938/TL168 的菌株提取物对HeLa 细胞增殖的IC50为（25.95±3.39）μg·mL-1，表明阿魏内生真菌提取物符合抗肿瘤药物体外筛选标准，可为新型抗肿瘤药物的研发提供新来源，具备开发为抗肿瘤新药的潜质。

4.2 新疆阿魏不同种属的内生真菌抗肿瘤活性存在较大差异

供筛的117 株阿魏内生真菌中具有抑制肿瘤细胞增殖活性的菌株有43 株，主要归属于链格孢属（Alternariasp.）。链格孢属在植物中分布较为广泛，从该属的内生真菌中分得的生物碱（如长春碱、细胞松弛素等）、萜类（如紫杉醇）、黄酮类等化合物具有较强的抗肿瘤活性，是一类具有抗癌应用潜力的生物资源[12-14]。而本研究中相关内生真菌发挥抗肿瘤活性的物质基础具体是什么，是否与其宿主阿魏抗肿瘤活性成分一致等问题有待进一步研究；同时，研究发现阿魏内生真菌不同种属提取物之间的抗肿瘤活性存在较大差异，而同一菌株的提取物对不同肿瘤细胞的增殖抑制作用也存在差异，这些作用的差异可能与不同种属提取物中化学成分结构的多样性有关。

4.3 新疆阿魏内生真菌的培养条件和提取方式与其抗肿瘤活性相关

研究结果显示，虽然2682/6626号菌株的菌液提取物对HeLa细胞的IC50为（30.53±2.84）μg·mL-1，但在所有受试提取物筛选结果中，菌丝体提取物的肿瘤增殖抑制作用效果明显优于菌液提取物，说明内生真菌活性成分的积累、释放可能与菌株所处的温度、光照、终止培养时间等外在因素密切相关，其产生与作用机制尚需进一步研究。如何大批量培养能稳定产生抗肿瘤活性物质的提取物将是今后研究的一个重要方向。