基于高通量测序的RNA相互作用研究方法概述

李星桥

武汉大学生命科学学院 湖北 武汉 430072

引言

RNA分子在细胞内并不是单独行使功能，而是通过与其他生物分子如DNA、RNA、蛋白质等发生交互来共同完成功能，RNA分子具有碱基互补配对的内在属性，使得其能形成更加复杂的结构从而适应于多样的生物学功能。RNA相互作用，是指RNA分子内部以及不同RNA分子间结合形成双链结构共同调节生物体功能[1]。这些互作信息对于理解RNA的生物学功能机制有着十分重要的作用。例如，mRNA的3’UTR目标区域可以被miRNA结合并抑制其翻译，lncRNA可以和mRNA结合促进其翻译[2]，而RNA分子自身也能形成双链，从而产生更加复杂的二级结构，进而与RNA结合蛋白结合并发挥功能。因此，如果我们能准确地获取细胞内部的RNA相互作用信息，将可以解释许多分子生物学功能和机制。

近年来，细胞内大规模地研究RNA相互作用的方法都是基于高通量测序技术开发。这些测序技术能够用于检测转录组范围的RNA互作，主要包括了PARIS[3]，RIC-seq[4]，hiCLIP[5]等测序方法。然而，RNA相互作用在生物体内是动态变化的，且不同的实验技术之间存在偏好性，所能检测到的RNA种类不同，此外部分实验方法依赖于特定RNA结合蛋白，因此不同的技术得到的RNA互作信息存在差异。根据具体的分析需求，我们应该采用合适的方法用于RNA互作研究。

1 PARlS技术原理介绍

在RNA互作研究中，各种新技术层出不穷，PARIS（Psoralen analysis of RNA Interactionsand Structures）是其中较为优秀的一种方法。PARIS技术利用了一种特殊的化学分子AMT[6]，该分子在365nm的紫外光照射下，可将细胞内RNA双链区域中的AU碱基对进行交联，这种交联是基于空间位置。交联过程完成后，将细胞裂解，接着利用蛋白酶和RNA酶，将细胞提取物中的蛋白以及未发生交联的RNA去除。之后，根据双链与单链结构的RNA分子在凝胶电泳中移动速度存在差异，利用生化中的2D胶对RNA提取物进行电泳，可以进一步纯化存在双链结构的RNA，最后切胶并回收得到具有双链结构的RNA片段。通过体外近端连接，将双链RNA连接形成更长的单链并建库。最后使用高通量测序技术，对得到的文库进行测序，并对测序结果进行下游生物信息分析，即可获取RNA分子在生物体内的形成的互作信息。

PARIS方法得到的RNA互作信息是细胞中的各种类型RNA分子内部以及RNA分子间形成的双链结构信息。该技术最大的创新点是基于化学分子AMT和紫外光在细胞内进行交联，且无需RNA结合至特定蛋白上，因此可获取各种类型的RNA互作信息，是一种广泛适用且灵活的方法。此外，PARIS实验大部分在细胞内进行，能够反映出细胞内RNA互作的真实状态。但是PARIS技术也存在一些缺点，例如细胞可能受到AMT分子和紫外光等物理化学因素的影响，实验最终得到的RNA相互作用信息不可避免地会受到干扰而与真实情况存在偏差。

2 RlC-seq技术原理介绍

类似于PARIS方法，RIC-seq(RNA in situ conformation sequencing)也是测定细胞转录组范围的RNA互作信息，不同的是该方法没有使用紫外光以及AMT分子进行交联，而是采用多种不同的酶对细胞内RNA进行处理从而达到获取RNA相互作用信息的目的。RIC-seq的具体实验步骤如下：a.将培养的细胞用甲醛进行固定，接着加入去垢剂处理，增加细胞的通透性；b.利用微球菌核苷酶对细胞内的RNA进行随机切割，此时与RNA结合蛋白结合的RNA互作片段将会被保留，其他RNA将被切割为小片段；用FastAP酶对保留下的RNA 3’端去磷酸化；c.在细胞培养皿中加入被生物素标记过的胞嘧啶，它将与RNA的3’端结合，并使之标记上生物素；d.用FastAP碱性酶去除RNA3’端上的磷酸基团；加入T4多核苷酸激酶使得RNA的5’端加上磷酸基团；此时，在非变性条件下，RNA的3’端与5’端则会发生邻近连接，构成新的RNA链，且该链的中间部分被生物素标记；e.将细胞裂解并提取RNA，进行片段化，富集含有生物素标记的RNA短片段，构建测序文库f.利用高通量测序技术对文库进行测序，接着对测序结果进行下游生物信息学分析，最终可获取细胞内RNA互作信息。

RIC-seq技术具有许多优点。首先该方法获取的RNA相互作用信息是真实存在于细胞内部，相比PAIRS在体外进行双链RNA连接会产生大量的假阳性连接信号，RIC-seq具有更高的分辨率与准确性，能捕捉到更多的RNA互作信息。但是该技术只能识别由RNA结合蛋白所介导的RNA-RNA相互作用，对于未与蛋白发生结合的RNA则并不能很好地检测到信号。这也限制了RIC-seq对细胞中RNA互作信息的获取范围。

3 hiCLlP技术原理介绍

hiCLIP(RNA hybrid and individual-nucleotide resolution ultraviolet crosslinking and immunoprecipitation)是一种检测特定蛋白所结合的RNA间相互作用的分析技术。相比于前面两种技术方法，hiCLIP所能得到的数据量较小，获取的信息量有限，只能得到某一特定的双链RNA结合蛋白上的RNA互作信息，但其实验步骤相对简单，所受的化学试剂以及物理因素影响较小，能够较为真实地反映细胞内RNA互作状态，对于需要关注某些特定蛋白上的RNA互作的研究者，该技术可能更为简便实用。

hiCLIP实验原理与CLIP实验基本相似，其具体实验流程如下：①将培养到一定密度的细胞用紫外光照射，使得RNA双链与其结合的蛋白形成共价交联；②加入去垢剂并将细胞破碎，获取细胞内RNA与蛋白形成的复合物；③得到的复合物用RNaseⅠ酶进行RNA降解处理，使得未与蛋白质发生结合的RNA片段全部降解；④利用特异性抗体，将双链RNA结合蛋白与RNA分子形成的复合物进行免疫沉淀，达到纯化具有相互作用RNA片段的目的；⑤第一轮接头连接，该步骤使用了A接头与B接头，接头B能够有效地将RNA双链连接起来形成长的单链，同时能保证连接反应受内源性连接酶的调控，在数据分析过程中，根据接头B的位置也能更准确地分辨出长RNA序列中原来的两条RNA双链所在的位置。接头A则包含逆转录的引物结合位点，保证RT-PCR的进行。A，B接头都连接在RNA双链的3’末端。⑥第二轮接头连接，利用B接头将双链RNA连接，进行第二轮免疫沉淀，同时用SDS凝胶电泳分离纯化复合物。从蛋白质-RNA复合物中提取RNA。利用带有UMI码的引物进行逆转录，构建cDNA文库。⑦通过高通量测序技术，对cDNA文库进行测序，并将得到的测序结果进行生物信息分析，最终获取细胞内特定蛋白的RNA互作信息。

4 结束语

上面三种技术都是典型RNA相互作用研究方法，但是这些技术却有各自的特点。hiCLIP技术是基于特定的RNA结合蛋白进行的实验，该蛋白要求是RNA双链结合蛋白，而且需要有该蛋白相应的抗体才能进行免疫沉淀实验，因此目前的应用范围十分狭窄，Staufen蛋白[7]是一种合适的RNA双链结合蛋白，但其他的双链结合蛋白靶标RNA特征仍然需要进一步研究，此外，该分析方法得到的数据绝大部分都是mRNA以及RNA分子内的相互作用。hiCLIP实验过程受到理化因素影响较小，能真实地反映出细胞内的RNA互作情况，且相比于全转录组，大多数研究者更关注于某一特定蛋白上的RNA互作信息，实用性更强。PARIS方法需要有AMT以及365nm紫外光的帮助才能完成实验，实验操作十分复杂，数据分析难度大，且存在一定的假阳性信号，但其得到的RNA相互作用数据是细胞内整体的情况，不存在特异性，较为灵活方便。PARIS获取的互作仍是以分子内的RNA相互作用居多，但是分子间的RNA互作信息量相比hiCLIP有所提升，这有利于分析生物体内的RNA-RNA相互作用网络。RIC-seq方法主要提取具有蛋白结合区域的RNA上的互作信息，其得到的互作信息准确度较高，可以精确到单核苷酸分辨率，且实验流程相对简单，而且不依赖于碱基配对，这对于发现更多的RNA互作信息起到关键作用，但对于未与蛋白发生结合的RNA互作信息，RIC-seq则无法进行检测。

讨论基于高通量测序的转录组RNA相互作用研究技术仍在不断发展，但是对于当前方法的数据分析结果显示，无论是数据量还是数据的类型，新技术与新技术之间仍存在着许多差异[8]。这可能提示我们，目前开发的技术所能检测到的RNA相互作用都是细胞内RNA互作信息的一部分，并不完全。因此我们可能需要将多种技术进行融合，结合各个技术所获取的分析数据，才能完整地构建细胞内部RNA相互作用网络。此外，相同的实验方法多次检测的结果之间也存在一定的差异，这也暗示了我们细胞中RNA相互作用是一个动态变化的过程，在不同时间，不同细胞类型所获取的RNA互作信息亦存在差异。因此，想要整体地研究细胞内RNA相互作用的分子机制，在目前看来仍然十分困难的，需要大量的投入和新的技术解决上述问题。

RNA与RNA相互作用在生物体中十分重要，随着这些高通量测序技术的开发，将会产生越来越多的数据。我们也可以利用这些实验数据，构建RNA相互作用网络。依据RNA互作网络，也有利于我们找到生物体中更加重要的靶标RNA，用于下游研究分析。研究RNA相互作用，对于癌症研究，药物研发，家族遗传病等，都会起到现实作用。