单载体吸附微生物的研究

王 格，杨 萌，杨明月，鲁 琳＊

1 北京农学院动物科学技术学院，北京 101300

2 农业农村部华北都市农业重点实验室，北京 102206

0 引言

固定化微生物技术（Imobilized Microorganlsins）是20世纪60年代在固定化酶技术的基础上发展起来的一项新技术，随着遗传工程、细胞工程、酶催化工程等高新技术的成熟发展和促进，目前已成为生物工程领域的一个重要分支[1]。固定化微生物具有微生物密度大、反应速度快、低污泥产量、耐环境冲击和反应过程容易控制等优点，吸引众多国内外学者对其研究。相较于固定化酶技术，固定化细胞技术有其独特的优势，也使得固定化细胞技术能够迅速发展及完善[2]。

一般载体会选择颗粒小、疏松、比表面积大并且pH值为中性（不足中性的用前调整到中性）的物质。载体不仅对于一定时间内维持菌剂中特定的微生物的活性、数量有十分重要的作用，还是决定菌剂质量的重要因素之一，将影响应用效果。但是即便采用相同的培养基和相同单位数量的载体，若固定化的方法不同，菌体与载体的结合方式以及结合程度也将会有所不同。因此，虽然能够作为载体的材料很多，但并非随便一种物质都可以作为菌剂载体的材料。据研究报道[3，4]，载体的种类、数量、大小、结构、形状等物理性质和结构特征对白腐真菌的培养及应用均有较大的影响作用。

吸附法是将细胞直接吸附于惰性载体上，分为物理吸附法和离子结合法。物理吸附法是利用硅藻土、多孔砖、木屑等材料作为载体，将微生物细胞吸附住；离子结合法是利用微生物细胞表面的静电荷在适当条件下可以为离子交换树脂进行离子结合和吸附制成固定化细胞。吸附法的优点是操作简便、载体可再生；缺点是细胞与载体的结合力弱，pH值和离子强度等外界条件的变化都可以导致细胞的解吸，使其从载体上脱落。

一部分学者认为在堆肥过程中没有必要接种菌剂，但还有大多数人认为，在人工条件下通过接种菌剂可以提高堆肥的微生物数量并加快堆肥反应进程。且早在20世纪40年代，美国就通过接种细菌从而使堆肥时间缩短了1～3 天。许多研究结果也充分肯定了接种菌剂在堆肥过程中的促进作用，所以，有不少学者已开始着力研究在堆肥不同阶段起关键作用的微生物，并开始进行自然界中的优质高效菌群的筛选以及接种技术的探讨。

本试验从不同发酵状态的废弃物中筛选获得的、纤维素酶活性较高的自选菌种，进行了单载体的吸水率、吸菌量，菌剂固定后的过氧化氢酶和纤维素酶的变化研究，为后续复合载体吸附微生物的试验提供了基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本课题组保存，从不同发酵状态的废弃物中筛选获得的纤维素酶活性较高的自选菌种：真菌ZZ9、细菌ZX5及ZH9。

载体：麦麸（MF）、锯末（JM）、干牛粪（GNF）、硅藻土（GZT）、蛭石（ZS）、珍珠岩（ZZY）、草炭（CT）。

1.2 试验仪器

灭菌锅、超净工作台、-80 ℃冰箱、摇床、培养箱、烘箱。

1.3 试验方法

1.3.1 单载体的吸水量测定

在无菌条件下将菌液与各载体充分混匀，每次加入5.0 mL菌液。使载体湿润，并保持疏松，且不结块。以菌剂所含的菌液量为载体吸水率，吸水率反映载体的吸附能力。

1.3.2 单载体的吸菌量测定

将菌剂放置在阴凉处保存，两天后取l0.00 g样品加入100 mL生理盐水在200 r/min下振荡2 h，然后立即用稀释平板计数法测定释放的菌数。

1.3.3 单载体吸菌后条件优化

（1）菌剂制作

在500 mL三角瓶中装入200 mL培养液，将ZX5、ZZ9、ZH9分别接种到发酵液体培养基中。

真菌的培养基为改良的高氏一号培养基：葡萄糖10.0 g，蛋白胨5.00 g，硝酸钾1.00 g，氯化钠0.50 g，磷酸氢二钾0.50 g，硫酸镁0.50 g，硫酸亚铁0.01 g，蒸馏水1 000 mL，pH值7.2～7.4。

细菌采用牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏3.00 g，蛋白胨5.00 g，氯化钠5.00 g，蒸馏水1 000 mL，pH值7.0～7.2。

在25 ℃下静置培养至对数期。

（2）载体制作称量三角瓶子重量m1，分别称量各种载体大约100.00 g于三角瓶中，于0.1 MPa，灭菌20 min后，放于烘箱中在60 ℃下烘干48 h直到衡重，称重为m2，由此得到载体净重。按载体的吸水率，分别向载体中加入相应菌液量，放于30 ℃下储存。分别在其第1、3、5、9、12、15、30天测定其纤维素酶酶活及过氧化氢酶酶活。

（3）酶活测定

a、纤维素酶活性测定（硝基水杨酸比色法）

葡萄糖标准溶液（1.0 mL标准液含0.2～0.8 mg葡萄糖）绘制：分别取不同浓度标准溶液1.0 mL移入25.0 mL容量瓶中，加3.0 mL二硝基水杨酸溶液。将试管放在沸腾水浴上5 min，然后迅速冷却3 min。定容，15 min后在分光光度计上于波长540 nm处比色测定。以光密度值为纵坐标，以葡萄糖浓度为横坐标，绘制标准曲线。

操作步骤：称1 g菌剂于50.0 mL三角瓶中，加20 mL 1%羧甲基纤维素溶液、5.0 mL pH值为5.5磷酸盐缓冲液及1.5 mL甲苯，将三角瓶放在37 ℃恒温箱中培养72 h。培养结束后，过滤并定容25.0 mL。取1.0 mL滤液，然后按照绘制标准曲线显色法比色测定。纤维素酶活，以72 h，10.00 g土壤生成葡萄糖毫克数表示。

b、过氧化氢酶活性测定

酶液提取：取10.0 mL试管4 支，2 支为样品测试管，2 支为对照，各管分别加入粗酶液0.2 mL。磷酸缓冲液（0.2 M，pH值7.8）1.5 mL，水1.0 mL。对照管加入的酶液为沸水浴中保持2 min的酶液。

活性测定：25 ℃预热后，逐管加入0.3 mL的H2O2溶液（0.1 M），每加完一管立即计时，并迅速测定其在240 nm下的吸光值，每隔1 min读数1 次，共测4 min，待4 支试管全部测完后，计算其过氧化氢酶酶活。

以1 min内A240减少0.1的酶量为1 个酶活单位：过氧化氢酶活性=（△A240·VT）（0.1V1·t·wF）-1

式中：A0为对照管加入煮死酶液吸光值；A1、A2为样品管吸光值；VT为粗酶液提取液总体积（mL）；V1为测定用粗酶液体积（mL）；wF为样品鲜重（g）；0.1为A240每下降0.1为1 个酶活单位；t为加过氧化氢到最后一次读数时间（min）

2 试验结果

2.1 单载体的吸水率

载体的吸水率越高，表明对菌的吸附能力越强。从表1可以看出，锯末、珍珠岩、硅藻土的吸水率比较高，也就说明这3 种载体的吸附能力比较好，对菌的吸附能力较强，吸水率依次是锯末＞珍珠岩＞硅藻土。其中，吸水率最高的锯末是吸水率最低的草炭的5.7 倍，也是吸水率第2高的珍珠岩的1.2倍。但载体的选择还应看随着时间的增长，其对菌的释放力，菌剂在载体上的存活时间以及菌剂的活力如何。

表1 单载体的吸水率

2.2 单载体的吸菌量

由图1可以看出，载体对于ZX5的吸附能力普遍较强，能达到1.0×1010～2.0×1010CFU/g，其中锯末、珍珠岩以及硅藻土的表现比较优秀；ZZ9次之，普遍在1.0×1010g，其中也是锯末、珍珠岩、硅藻土的表现比较好；而对于ZH9的吸附能力则很弱，只有1.0×109g左右，锯末、珍珠岩和硅藻土的表现较为突出。这也验证了吸水率较好的载体对于菌的吸附性也很好。

图1 单载体的吸菌量

2.3 菌剂固定后的过氧化氢酶变化

过氧化氢酶（Catalase）又叫接触酶，可以促进堆肥中有机物的氧化分解。过氧化氢是代谢过程中产生的废物，会对机体造成一定损害，因此，必须迅速将过氧化氢转化为其他无害或毒性较小的物质。而过氧化氢酶便是用与催化细胞中的过氧化氢分解的工具，几乎所有的生物机体都存在过氧化氢酶，其酶促活性为机体提供了抗氧化防御机理。本研究通过测定各菌种固定后的过氧化氢酶活性，各菌种固定后随着储存时间延长，其酶活性的变化表现不同。据此将3 种菌固定在7 种载体上的酶活变化：菌种ZH9和ZZ9，二者固定在麦麸及干牛粪上的过氧化氢酶活性变化呈现“山峰”型，即均经历了先升高再降低的过程，并且其酶活性在第2～4 天达到最高峰。

由图2可以看出，菌ZH9在麦麸及干牛粪上的过氧化氢酶活性较高，尤其是在麦麸上的表现较好。在第4天几乎所有载体的过氧化氢酶活性均出现峰值，随后都开始降低，除麦麸外的载体在第5天以后活性都接近0；而在麦麸上的过氧化氢酶活性则逐渐降低，在第7天的时候活性才消失。

图2 ZH9的过氧化氢酶活性

由图3可以看出，菌ZZ9在麦麸上的过氧化氢酶活性表现较为突出，其次为干牛粪，但在第4天以后几乎所有载体上ZZ9的过氧化氢酶活性都几乎为0，只有干牛粪上的过氧化氢酶活性持续性较好，稳定性也较好。

图3 ZZ9的过氧化氢酶活性

由图4可以看出，菌ZX5在载体上的过氧化氢酶活性相对于其他菌剂来说普遍不高。ZX5在干牛粪上的过氧化氢酶活性较其他载体一直偏高，在第3天时出现峰值。总体来说，ZX5菌的过氧化氢酶活性普遍较高。

图4 ZX5的过氧化氢酶活性

2.4 菌剂固定后的纤维素酶变化

纤维素酶（Cellulase）是酶的一种，在分解纤维素的过程中起生物催化作用。细菌、真菌、动物体内等都可以产生纤维素酶。纤维素是地球上分布最广、含量最丰富的碳水化合物，占全球植物总干重的30%～50%，是植物细胞壁的主要成分[5]。而且纤维素还是牛粪堆肥原料中比较难分解的成分，它可在纤维素酶作用下水解为纤维二糖，进而水解为葡萄糖[6]。本研究纤维素酶活性是以72 h后1 g肥生成的葡萄糖mg数表示。

由图5可以看出，菌ZH9在麦麸上的纤维素酶活性比较高，其走势呈现一种先下降后缓慢上升的过程；在锯末上的纤维素酶活性次之，但相对来说比较平稳。在其他载体上的活性几乎为0。而在接种初始阶段，该菌在麦麸与锯末上的纤维素酶活性较高；而在接种的最后阶段亦是这两种载体上的纤维素酶活性较高。

图5 ZH9的纤维素酶活性

由图6可以看出，菌ZZ9在麦麸上的纤维素酶活性表现较好，其走势经历一个先下降后缓慢上升的的变化，并在最后达到其高峰。而该菌在其他载体上表现一般，其纤维素酶活性都接近0。

图6 ZZ9的纤维素酶活性

由图7可以看出，菌ZX5的纤维素酶活性在麦麸上的表现最为突出，其酶活经历了一个先下降，后上升的过程，并在接种的最后达到了峰值。该菌在锯末上的表现次之，其纤维素酶活性较之麦麸偏低，但其酶活的变化不是很显著，比较平稳。而其他几种载体显然不适合ZX5菌的保存及再繁，其纤维素酶活性几乎为0。

图7 ZX5的纤维素酶活性

3 结论

在过氧化氢酶酶活的测定中，麦麸及干牛粪的表现均比较优秀且3 种菌都在第6～8天的时候出现峰值。在纤维素酶酶活的测定中，亦是麦麸与干牛粪的表现较为突出，而在后期接到麦麸上的3 种菌的纤维素酶酶活都大幅度提高，可能是到后期载体中的营养物质比较少，微生物便开始分泌纤维素酶消化载体中的纤维素。

综上所述，从单载体试验中可以挑出以下4 种适合ZX5、ZZ9、ZH9三种菌吸附的载体：麦麸、硅藻土、干牛粪及锯末。因此，在复合载体的试验中，表现比较好的有机载体麦麸可以为微生物提供所需要的营养，而锯末的吸水性较好且疏松透气，适合作为载体的支架物质，3 种菌在干牛粪因其蓬松，富含有机质的特点表现相对较好，尤其将干牛粪作为载体可以缩短其接种到牛粪后的适应期，而硅藻土则主要作为无机载体来吸附微生物。