急性进展性缺血性脑卒中与急性非进展性缺血性脑卒中的代谢特征差异

赖敏超，朱梦婷，周丹雅，张晓娟，张 也，刘清娴，王 典

(1．汕头大学医学院第一附属医院神经内科，广东 汕头 515041；2．汕头大学医学院法医学教研室，广东 汕头 515041；3．汕头大学医学院护理系，广东 汕头 515041)

脑血管疾病占我国居民死因的第3位，其中缺血性脑卒中病例占全部脑血管疾病的80%以上[1]。急性进展性缺血性脑卒中(acute progressive ischemic stroke，APIS)是缺血性脑卒中的重要类型，该病征的症状进展快，治疗效果差[2]。目前，导致APIS的病理生理机制仍未完全清楚，需从不同层面探寻相关病理生理特征[3]。血清代谢组学可反映患者整体代谢与机能状态，有望为了解进展性脑卒中的病理生理过程和精准治疗提供参考。本研究探讨APIS与急性非进展性缺血性脑卒中(acute non-progressive ischemic stroke，ANPIS)患者血清代谢组的差异。

1 资料与方法

1.1 研究对象

选取15例APIS患者和25例ANPIS患者为研究对象。急性缺血性脑卒中(acute ischemic stroke，AIS)的诊断标准参照《中国急性缺血性脑卒中诊治指南2018》[4]：(1)急性起病；(2)局灶神经功能缺损(一侧面部或肢体无力或麻木，语言障碍等)，少数为全面神经功能缺损；(3)影像学出现责任病灶或症状/体征持续24 h以上；(4)排除非血管性病因；(5)脑CT/MRI排除脑出血。APIS的诊断参考文献[3]：入院后至第5天期间，美国国立卫生研究院卒中量表(National Institute of Health Stroke Scale，NIHSS)评分增加2分或以上(或出现卒中相关死亡)。其他急性缺血性脑卒中病例归为ANPIS。排除标准为有以下情况之一：严重的肝肾功能不全、严重感染、恶性肿瘤以及无法进行头部影像学检查(CT/MRI检查)。本研究经汕头大学医学院伦理委员会批准，入选患者均签署知情同意书。

收集研究对象的性别、年龄、高血压及糖尿病病史、NIHSS评分、改良Rankin量表(modified Rankin scale，mRS)评分、生化指标等临床资料。采集研究对象空腹外周血3 mL，4℃、3 000 r/min离心5 min，分离血清，将血清冻存于-80℃待测。

1.2 代谢组分析

1.2.1 血清标本预处理 血清解冻、振荡后，取50 μL 于 EP 管中，加 800 μL 甲醇和 50 μL 超纯水，旋涡振荡1 min；4℃，10 000 r/min离心10 min；取200 μL上清至GC管，并加入 20 μL 0.5 mmol/L正亮氨酸内标；70℃，用氮吹仪吹干约15 min；加入20 μL二氯甲烷，继续吹干约3 min；往GC管加入30 μL甲氧胺吡啶溶液(15 mg/mL)，室温放置16 h，加入30 μL N-甲基三甲硅基三氟乙酰胺(含1%三甲基氯硅烷作为催化剂)，室温放置1 h后上机检测。

1.2.2 GC-MS检测条件 使用美国Agilent 7890/5975气相色谱质谱联用仪和Agilent DB-5MS色谱柱(30 m×250 μm ×0.25 μm)。色谱条件：不分流进样，柱温采用程序升温，溶剂延时10 min，初始温度60℃，保持2 min，以5℃/min升至285℃，保持10 min，载气为高纯氦气，流速1 mL/min；进样量1 μL，进样口温度 230℃，接口温度290℃。质谱条件：采用EI源，电子轰击电压70 eV；离子源温度230℃；四级杆温度150℃；扫描方式为全扫描，扫描范围为35～800 u。

1.2.3 代谢轮廓分析 将所检测到的代谢指纹图谱导入Agilent自带的ChemStation软件，转换成CDF格式，运用R 2.7.2语言软件进行质谱数据提取，生成数据矩阵，导入SIMCA 13.0.3进行偏最小二乘法判别分析(partial least squares discrimination analysis，PLS-DA)建模，分析患者血清的代谢轮廓。根据荷载图分布情况以及R2Y与Q2判断组间总体代谢轮廓的差异(R2Y反映模型的稳定性，Q2反映模型的预测性，两者越接近1，说明模型的稳定性和预测性越好)。

1.2.4 代谢物的定性及差异分析 GC-MS代谢谱导入Chem Station软件，参考美国国家标准与技术研究院谱库来定性代谢物。主要参考匹配度(Match)、可能性(Probability)及保留指数(Retention index)等指标来鉴定各种代谢物。应用Chem Station软件生成色谱图的离子峰的峰面积，进行相对定量。差异代谢物采用人类代谢组学数据库(HMDB，http://www.hmdb.ca/)、京都基因与基因组百科全书(KEGG，http://www.kegg.jp/kegg/pathway.html)筛选相关的代谢通路。

1.3 统计学分析

应用SPSS 17.0统计软件进行分析，符合正态分布的计量资料以±s表示，组间比较用t检验；非正态分布的计量资料以中位数和四分位数间距[M(Q1,Q3)]表示，组间比较采用Mann-WhitneyU检验。计数资料以例数和构成比表示，组间比较用χ2检验；计量资料之间相关性采用Pearson相关分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般资料

APIS组患者的出院NIHSS评分、mRS评分明显高于ANPIS组(均P＜0.05)，提示前者预后更差，与该类患者的临床特征相符。此外，APIS患者中，谷草转氨酶、谷丙转氨酶、肌酐等反映肝肾功能的指标高于ANPIS组(均P＜0.05)。两组患者在性别、年龄以及高血压、糖尿病、房颤患病率、血脂、血糖值、凝血相关指标等方面的差异无统计学意义(均P＞0.05)。见表1。

表1 患者的基本临床信息及生化指标

2.2 代谢轮廓的差异

基于GC-MS数据的PLS-DA的荷载图显示两组明显分开，其PLS-DA荷载图区分良好，R2Y=0.568，Q2=0.534，提示APIS患者与ANPIS患者的血清代谢组差异显著，见图1。

图1 PLS-DA荷载图

2.3 差异代谢物及相关代谢通路

患者血清中鉴定出31种代谢物，其中两组差异有统计学意义(P＜0.05)的8种(表2)，包括在APIS患者中上调的苏氨酸、顺式棕榈酸、棕榈酸、反油酸、丝氨酸，以及下调的脯氨酸、次黄嘌呤、谷氨酰胺。这些代谢物所反映的代谢通路主要包括精氨酸与脯氨酸代谢、磷脂酰乙醇胺合成代谢、甘氨酸与丝氨酸代谢、嘌呤代谢、甘油酯代谢与脂肪酸代谢以及嘌呤代谢与鸟氨酸循环等(表2)。其中的6种差异代谢物与脑卒中的风险因子存在一定的相关性，特别是脂肪酸(顺式棕榈酸、棕榈酸)与NIHSS评分存在正相关(表3)，提示其很可能参与APIS症状的恶化过程。

表2 APIS患者与ANPIS患者血清差异代谢物

表3 差异代谢物与脑卒中的危险因子及血生化指标的相关性

3 讨论

APIS因病情进展快，预后差，是神经内科中面临的重难点问题[2-3]。因此，进一步了解APIS的病理生理过程具有重要意义。血清代表个体的整体代谢水平，能更直接地反映患者的整体机能状态。血清代谢组学已被用于探讨脑卒中发生的病理生理机制，并筛选相关的诊断与鉴别诊断标记物[5-6]。目前应用代谢组学方法发现缺血性脑卒中的代谢障碍主要涉及氨基酸代谢、能量代谢、叶酸循环代谢和脂类代谢等。目前未见APIS代谢组学研究的报道。本研究通过比较APIS与ANPIS患者之间血清代谢组的差异，有望找到APIS相关的代谢特征，为诊治提供新的线索。

本研究发现，APIS患者与ANPIS患者血清代谢轮廓差异显著，提示代谢很可能是参与APIS病情进展与恶化的关键因素。本研究在血清中共筛选到了8种差异代谢物，其中上调的5种，包括2种氨基酸(苏氨酸、丝氨酸)与3种脂肪酸(顺式棕榈酸、棕榈酸、反油酸)，提示了其相关的甘氨酸与丝氨酸代谢、甘油酯代谢、脂肪酸代谢、磷脂酰乙醇胺合成代谢等通路参与APIS。丝氨酸与脂肪酸的升高，反映了细胞膜磷脂分解的增强，提示在APIS的状态下，细胞与细胞膜系统的破坏更明显，梗死细胞的坏死更严重[7]。下调的代谢物有3种，包括2种氨基酸(脯氨酸、谷氨酰胺)与1种核苷酸前体(次黄嘌呤)；反映了在APIS状态下脯氨酸代谢、嘌呤代谢与鸟氨酸循环、精氨酸与脯氨酸代谢可能被明显抑制。谷氨酰胺在脑中固定转运氨中发挥重要作用，其含量下降，提示APIS状态下，更多的谷氨酰胺被用于氨的转运，也提示APIS具有更显著的神经毒性症状。次黄嘌呤在代谢过程可产生氧化应激，其含量的下降表明更多的次黄嘌呤代谢导致活性氧的增加[8]。该结果提示APIS状态下具有更高的氧化应激水平，这与已报道的APIS发生机制相符[2-3]。

综上所述，APIS患者与ANPIS患者的血清代谢组存在差异，提示APIS与严重的膜磷脂的破坏、神经细胞坏死、神经毒性、氧化应激有关。