利用土壤线虫生态指标表征砂姜黑土土壤健康状况的探讨

耿文敬 曹 森 樊 琼 张 鑫, 齐 俊,4 王晓飞 朱 江 郭肖颖*

(1.安徽农业大学 资源与环境学院，合肥 230036； 2.安徽省农业科学院 农业工程研究所，合肥 230031； 3. 合肥学院 生物食品与环境学院，合肥 230601； 4. 合肥工业大学 资源与环境工程学院，合肥 230009)

土壤是人类赖以生存的重要资源，是农田生态系统的基础，土壤健康状况直接关系到环境质量和农产品安全。开展土壤健康评价，对于保障粮食安全和推进土壤可持续发展具有重要的现实意义[1]。目前针对土壤健康状况的评价方法有多种，较常用的有内梅罗指数法[2]、模糊判别法[3]、灰色聚类法[4]、地质累积指数法[5]等评价法，这些评价方法各有其适用条件，但由于需要人为对评价指标赋权，存在一定主观判断上的局限。土壤线虫是土壤中一类十分活跃的生物，在土壤有机质的分解、营养物质的转化、养分循环和土壤理化性状的改善等方面发挥十分重要的作用，在土壤生态链中占有重要地位[6]。已有研究表明土壤线虫的群落组成可以反映土壤的健康状况、污染状况、有机物质的输入状况及自然和人类的干扰程度等[7-9]。随着对土壤线虫生态多样性研究的深入，土壤线虫常作为生物多样性的指示因子，用来评价土壤的健康状况和农田生态系统的稳定性[10-12]。

砂姜黑土是典型的中低产土壤，结构不良，缺磷少氮，有机质含量低，种植小麦玉米等农作物产量普遍较低[13-14]。施肥是砂姜黑土区域小麦增产的关键，其中施用氮肥对小麦增产的贡献率达到69.4%[15]，施用磷肥平均亩产可增加95.1%[16-17]。目前关于砂姜黑土的研究多集中在研究土壤养分、作物产量、细菌群落等，将土壤线虫作为指示生物来评价土壤健康状况的报道尚少[18-19]。因此，本研究基于安徽省农业科学院蒙城砂姜黑土有机肥长期定位试验基地，拟以土壤线虫生态指标的变化作为土壤健康的指示因子，分析土壤线虫数量、营养类群、生态指数的变化与土壤肥力水平的相关性，并进一步关联作物的产量指标，探讨利用土壤线虫生态指标表征砂姜黑土土壤健康状况的可行性。

1 材料与方法

1.1 试验区概况

本研究以安徽省农业科学院蒙城砂姜黑土有机肥长期定位试验基地为研究对象。该试验站位于安徽省亳州市蒙城县马店村(116°37′ E，33°13′ N)，属于半湿润气候，年平均气温16.5 ℃，有效积温5 479 ℃，年平均降雨量870 mm，年水分蒸发量为1 027 mm，代表黄淮海平原典型的砂姜黑土区。

长期定位试验开始于1982 年，冬小麦-大豆轮作，多年的长期定位施肥形成了不同肥力等级的稳定土壤环境。试验设5 个处理(表1)，每个处理4 次重复，共20 个试验小区，每个试验小区面积为66.7 m2，小区采用完全随机区组排列。秸秆含氮5.5 g/kg、碳482 g/kg；猪粪(干基)含氮17 g/kg、碳367 g/kg；牛粪(干基)含氮7.9 g/kg、碳380 g/kg；全部有机肥料和无机肥料于每年小麦种植整地前一次性施入，后茬大豆不施肥[20]。

表1 长期定位试验施肥处理Table 1 Long-term located experiment fertilization treatment

1.2 土壤样品采集

2019年采集该基地小麦收获后不同施肥处理的土壤样品。土样采集时采用“S”形五点取样法，每个试验小区随机采集5 个样点的土壤混合成一个土样，20 个试验小区共采集20 份土样，每个试验小区采集约500 g土壤。取样为0～20 cm的耕层土壤，将取好的土样装入塑料袋并编号，4 ℃保存备用。

1.3 土壤线虫提取及鉴定

庶糖离心漂浮法是比较高效常用的土壤线虫分离法，过程中采用淘洗—过筛—蔗糖梯度密度离心浮选的方法提取[21]。称取50 g鲜土于离心管中，加约100 mL水并充分混匀，置于离心机内以2 000 r/min 离心5 min，弃掉上清液，加入蔗糖溶液(0.8 g/mL)搅匀，再次以1 000 r/min离心1.5 min，将上清液倒入预先装水的烧杯里，将烧杯内的液体通过用60、400和500目筛网过筛并用水冲洗，最后将400和500目筛网里的线虫洗到塑料培养皿中。分离的线虫经24 h饥饿处理后，用TAF固定液(40%甲醛，7 mL；三乙醇胺，2 mL；蒸馏水，91 mL)固定，在生物显微镜下进行计数和线虫属的鉴定。每个处理取50 g鲜土分离出全部线虫，根据土壤含水量换算成100 g干土中的线虫数量，每个样品做三次重复。根据线虫的头部、尾部的形态学特征和取食特性将其划分为4 个营养类群：植物寄生线虫、食细菌线虫、食真菌线虫、杂食/捕食线虫[22]。线虫的种属鉴定参见《中国土壤动物检索图鉴》[23]。

1.4 线虫生态学指数度量方法

本研究中采用的线虫生态学指数有香农多样性指数、均匀度指数、优势度指数、植物寄生线虫成熟度指数、瓦斯乐斯卡指数、线虫通路指数，计算公式如下：

香农多样性指数

H′=-∑pilnpi

(1)

均匀度指数

J′=H′/lnS

(2)

优势度指数

(3)

植物寄生线虫成熟度指数

PPI=∑vif′i

(4)

瓦斯乐斯卡指数

WI=(BF+FF)/PP

(5)

线虫通路指数

NCR=BF/(BF+FF)

(6)

式中：pi为第i个分类单元中个体占线虫总个体数量的比例；S为线虫分类单元数；vi为根据土壤线虫在生态演替中的不同生活策略赋予的cp值；f′i为植物寄生线虫科/属在线虫种群中所占的比重；BF、FF和PP分别为食细菌线虫、食真菌线虫和植物寄生线虫的数量。

1.5 土壤理化指标测定

土壤理化性质的测定皆采用常规法：pH，m(水)∶m(土)=2.5∶1，进行酸度计测定；有机质，重铬酸钾加热法；全氮，开氏法；碱解氮，碱解扩散法；硝态氮，紫外分光光度法；全磷，氢氧化钠碱融-钼锑抗比色法；有效磷，碳酸氢钠浸提-钼锑抗比色法；全钾，氢氧化钠碱融-火焰光度法；速效钾，乙酸铵浸提-火焰光度法[24]。

1.6 小麦产量测定

2019年小麦收获期，在每个试验小区随机选取5 个样点，每个样点收获1 平方米范围内的全部小麦脱粒测产。

1.7 数据统计与分析

统计数据采用SPSS 25.0软件进行方差分析及主成分分析，用 LSD 新复极差法进行显著性检验，图表采用Microsoft Excel 2010生成。

2 结果与分析

2.1 不同施肥条件下的土壤肥力

2.1.1不同施肥条件下的土壤养分

对砂姜黑土试验小区的土壤养分进行分析测定，不同施肥处理的土壤养分情况见表2。与CK相比，NPK+PM、NPK+CM提高了土壤pH，而NPK、NPK+S处理与CK相比则显著降低了土壤pH(P<0.05)。与不施肥相比，牛粪配施、猪粪配施能显著提高土壤pH，而单施化肥以及秸秆配施处理则显著降低了土壤pH。与CK相比，NPK、NPK+S、NPK+PM、NPK+CM 4 个施肥处理的土壤有机质、全氮、碱解氮、有效磷、速效钾含量显著提高(P<0.05)，其中长期施肥处理的土壤有机质含量与CK相比分别提升了28.95%、53.98%、103.44%和105.55%。NPK+CM、NPK+PM 2个粪肥配施处理的土壤有机质、碱解氮、全磷和有效磷含量与NPK相比有显著提高(P<0.05)，其中土壤有机质含量较NPK分别提高了32.12%和33.49%。

2.2.2基于主成分分析的土壤肥力

本研究选取pH、有机质、全氮、碱解氮、硝态氮、全磷、有效磷、全钾和速效钾9个养分因子，采用主成分分析法对不同施肥处理的土壤肥力水平进行评价，结果见表3。按照主成分分析特征值>1的原则，提取了2个主成分。如表3所示，第1主成分对总方差的贡献率为65.455%，第2主成分的贡献为22.070%，累计贡献率达到87.525%，说明提取的2个主成分基本能反映土壤肥力的信息。由表4因子载荷矩阵可知，第1主成分与有机质、碱解氮、全磷、有效磷、速效钾正向密切相关，其因子载荷值均大于0.95，表明有机质、碱解氮、全磷、有效磷、速效钾含量的变化对土壤肥力水平差异起主要影响作用。第2主成分与pH、全钾正向密切相关(因子载荷值在0.50以上)，这表明土壤pH、全钾含量也是土壤肥力水平差异的关键作用因子。

表3 主成分特征向量及累计贡献率Table 3 Eigenvectors and cumulative contribution rate principal component

表4 初始因子载荷与成分得分系数矩阵Table 4 The initial factor load and component score coefficient matrix

表5 各土壤肥力指标标准化数据Table 5 Standardized data for soil fertility indicators

表6 土壤肥力等级综合评价结果Table 6 Comprehensive evaluation of soil fertility grades

2.2 不同施肥条件下的土壤线虫生态指标

2.2.1不同施肥条件下的土壤线虫数量

试验对不同肥力水平的土壤线虫数量分析结果显示，线虫总数范围为307～787条/100 g干土，不同肥力条件的土壤线虫总数存在显著差异(图1，P<0.05)，其中NPK+S的线虫总数最多，达到787条/100 g(干土)，CK的线虫总数最少。与CK相比，NPK、NPK+S、NPK+PM、NPK+CM四个肥力水平相对高的施肥处理线虫总数显著高于不施肥处理，表明提高土壤肥力能够显著增加土壤线虫总数。与单施化肥相比，有机无机肥配施NPK+S、NPK+PM、NPK+CM的线虫总数显著提高，表明长期有机无机肥配施处理的土壤线虫总数显著高于单施化肥处理。有机无机肥配施处理中，NPK+PM、NPK+CM的土壤线虫总数显著低于NPK+S，表明长期秸秆配施处理对线虫总数的提高效果优于猪粪配施和牛粪配施。

土壤线虫总数由大到小依次是NPK+S>NPK+CM>NPK+PM>NPK>CK，可以发现肥力水平相对较低的NPK+S线虫总数高于NPK+CM和NPK+PM，这与土壤肥力水平的变化趋势并不一致。可能是由于土壤线虫总数包含了植物寄生类线虫、食细菌类线虫、食真菌类线虫和杂食-捕食类线虫4 个营养类群，其中植物寄生线虫以作物根系为食，是对作物生长有害的一类线虫，其所占比例的增加并不能提高土壤的健康水平[25]。因而，利用土壤线虫数量指示土壤健康状况具有一定的局限性。

图1 不同肥力水平对土壤线虫数量的影响Fig.1 Effects of different fertility levels on the number of soil nematodes

2.2.2不同施肥条件下的土壤线虫营养类群

对土壤线虫营养类群的分析结果见表7，试验共鉴定出20 个属线虫，其中，CK鉴定出16 属，NPK鉴定出15 属，NPK+S鉴定出19 属，NPK+PM鉴定出18 属，NPK+CM鉴定出18 属。与CK相比，有机无机肥配施处理NPK+S、NPK+PM、NPK+CM明显增加了线虫属的数量，由于有机无机肥配施处理的土壤肥力显著高于不施肥处理，因此可以说明提高土壤肥力能增加砂姜黑土土壤线虫属的数量。所有土壤肥力条件的优势属线虫共有5 种，分别为螺旋属、矮化属、短体属、丝尾垫刃属、真头叶属。CK、NPK、NPK+S处理优势属主要是螺旋属、矮化属、短体属和丝尾垫刃属等对土壤健康有害的植物寄生线虫属，而土壤肥力较高的粪肥配施处理NPK+PM、NPK+CM则出现真头叶属一类的食细菌线虫成为优势属。NPK+PM、NPK+CM处理的植物寄生线虫的相对丰度显著低于CK、NPK、NPK+S处理，与CK相比，NPK+PM、NPK+CM处理的植物寄生线虫相对丰度分别下降28.38%、35.45%。由于植物寄生线虫一般以取食植物为生，因此NPK+PM、NPK+CM处理比CK土壤更有利于作物生长，可能因为猪粪配施和牛粪配施抑制了植物寄生线虫的发生，增加了食细菌性线虫的相对丰度[26]。刘艳军等[27]的研究结果同样表明长期有机无机肥配施不仅大大提高了土壤中食细菌线虫的相对丰度，而且能明显降低植物寄生线虫的数量，对土壤植物寄生线虫的多样性也有明显的抑制作用，有利于土壤发育和作物生长。

2.2.3不同施肥条件下的土壤线虫生态指数

由表8可见不同肥力条件下的香农多样性指数(H′)的大小在2.00～2.51，均匀度指数(J′)的大小在0.67～0.85，瓦斯乐斯卡指数(WI)的大小在0.18～0.61。NPK+PM的H′值、J′值和WI值最大，CK最小。土壤肥力水平较高的长期施肥处理香农多样性指数(H′)、均匀度指数(J′)和瓦斯乐斯卡指数(WI)较CK显著提高(P<0.05)。与NPK相比，NPK+PM和NPK+CM的H′值、J′值和WI值显著提高(P<0.05)。NPK+S与NPK的H′值、J′值和WI值差异不显著，NPK+PM和NPK+CM之间H′值、J′值和WI值差异不显著。

NPK、NPK+S的优势度指数(λ)比不施肥略有降低，但差异不显著。NPK+PM、NPK+CM的优势度指数(λ)较CK显著降低(P<0.05)，NPK+PM和NPK+CM的λ值差异不显著。本试验中，所有肥力水平的线虫通路指数(NCR)在0.77～0.88，表明试验中土壤有机质分解过程主要以细菌分解为主。

表7 不同类群的土壤线虫的平均丰度和所占比例Table 7 Average abundance and proportion of soil nematodes of different groups

表8 不同施肥处理的土壤线虫生态指数Table 8 Ecological index of soil nematodes under different fertilization treatments

植物寄生线虫成熟度指数(PPI)在长期施肥和不施肥之间差异显著(P<0.05)，其中NPK、NPK+S、NPK+PM、NPK+CM的PPI值显著低于CK。有机无机肥配施处理中，NPK+S的PPI值显著高于NPK(P<0.05)，而NPK+PM、NPK+CM的PPI值显著低于NPK(P<0.05)。

2.2.4不同肥力水平的小麦产量及构成

为了进一步证明土壤线虫生态指标表征土壤健康状况的可行性，本试验在小麦成熟期进行了测产，结果如图2所示。结果表明，通过30 多年的定位施肥，肥力水平相对较高的施肥处理NPK、NPK+S、NPK+PM、NPK+CM，其小麦千粒重、每平方米穗数、穗粒数以及产量都远远高于CK。图2(d)可以看出，不同长期施肥处理的小麦产量存在显著差异，小麦产量表现为NPK+CM>NPK+PM>NPK+S>NPK>CK，NPK、NPK+S、NPK+PM、NPK+CM的产量较CK分别提升了337.87%、396.14%、495.43%和534.24%，表明随着土壤肥力水平的提高，砂姜黑土作物产量显著增加。有机无机肥配施NPK+S、NPK+CM、NPK+PM比NPK对作物产量提升的幅度更大，表明有机无机肥配施是砂姜黑土作物产量提升的重要途径。有机无机肥配施处理中NPK+CM对小麦产量提升的效果最好，其次是NPK+PM，NPK+PM效果优于NPK+S。

图2 不同肥力水平的小麦产量及构成因素Fig.2 Wheat yield and composition factors under different fertility levels

2.3 土壤线虫生态指标与土壤肥力和小麦产量及构成的相关性分析

为探讨土壤线虫生态指标的变化与土壤肥力水平、小麦产量及构成的关系，将上述所做土壤肥力指标、小麦产量及构成指标与土壤线虫生态指标做了相关性分析。Spearman相关性分析结果如表9 所示，可以发现，土壤肥力综合得分IFI与植物寄生线虫数量、食细菌线虫数量、杂食/捕食线虫数量显著正相关，与土壤线虫生态指数WI、H′、J′值显著正相关，与PPI和λ值显著负相关。小麦千粒重与食细菌线虫数量、WI、H′、J′值显著正相关，与植物寄生线虫数量、PPI、λ值显著负相关。小麦产量与H′、J′值显著正相关，与λ值显著负相关。结果表明，IFI、小麦产量与土壤线虫生态指标之间具有显著的相关性，土壤线虫生态指标的变化与土壤肥力水平的差异具有一致性。

3 讨 论

土壤肥力是土壤供给作物生长所需养分的能力，其核心是土壤中各种养分的含量。土壤养分含量与土壤肥力的高低密切相关[28]。作物生长需要持续从土壤中带走一部分养分，不对土壤做施肥处理会持续降低土壤的养分含量，即降低土壤肥力水平[29]。毛伟等[30]研究有机氮替代对土壤养分的影响发现施肥处理能显著增加土壤肥力，提高土壤有效养分的含量。邹文秀等[31]研究发现长期施有机肥能显著提高土壤肥力，增加土壤有机碳、全氮、全磷、碱解氮、速效磷和速效钾的含量。本研究中，长期不同施肥处理的土壤肥力也不同，肥力水平由高到低的顺序是：猪粪配施>牛粪配施>秸秆配施>单施化肥>不施肥，与江春等的研究结果一致[29]。

表9 土壤线虫生态指标与土壤肥力条件和小麦产量及构成的相关性Table 9 Correlation of soil nematode ecological index with soil fertility conditions and wheat yield and composition

土壤健康状况与土壤中各种养分的含量密切相关，土壤肥力的变化会直接或间接影响土壤线虫群落结构，通过改变土壤线虫的生态指标来表征土壤的健康状况[32-34]。本试验中，随着土壤肥力水平的提高，线虫香农多样性指数(H′)、均匀度指数(J′)和瓦斯乐斯卡指数(WI)显著提高，植物寄生线虫成熟度指数(PPI)显著降低，表明肥力水平的提高能够增加土壤线虫的物种多样性和种群分布的均匀性，增强土壤线虫群落结构的稳定性，同时能够降低土壤中植物寄生线虫的比例，使土壤生态系统向稳定健康的方向发展。上述结果与任宏飞等[35]研究结果一致，说明采用土壤线虫生态指数表征砂姜黑土的土壤健康状况是可行的。

因为试验是砂姜黑土在长期定位下不同施肥处理的条件下进行，因此，土壤肥力水平与土壤线虫生态指标的变化与施肥处理密切相关。有机肥和无机肥配施处理的条件下，猪粪配施和牛粪配施处理的线虫香农多样性指数(H′)、均匀度指数(J′)和瓦斯乐斯卡指数(WI)较单施化肥均显著提高，植物寄生线虫成熟度指数(PPI)较单施化肥显著降低，这与土壤肥力水平所表现的趋势一致，表明肥力水平相对较高的猪粪配施和牛粪配施处理对土壤线虫的生物多样性更好，更能优化土壤线虫的群落结构，并且能降低有害的植物寄生线虫线虫的比例，这与前人的研究结果相一致[36-38]。因此，采用香农多样性指数(H′)、均匀度指数(J′)、瓦斯乐斯卡指数(WI)和植物寄生线虫成熟度指数(PPI)可以表征砂姜黑土的土壤健康状况。

土壤线虫生态指标的变化与土壤肥力水平密切相关，土壤肥力水平直接的表达就是地上部分作物的产量高低[39-40]。本研究发现，土壤肥力水平相对较高的长期施肥处理，其土壤有机质、全氮、碱解氮、有效磷、速效钾含量明显增加，小麦千粒重、每株穗数、穗粒数以及产量都远远高于肥力水平最低的不施肥处理，表明土壤肥力水平是影响小麦产量高低的重要因素[41]。

土壤线虫群落结构的变化与地上作物产量的形成显著相关[42-43]。该观点在本研究中得到证实。本研究发现：随着土壤肥力水平的提高，线虫香农多样性指数(H′)、均匀度指数(J′)和瓦斯乐斯卡指数(WI)显著提高，植物寄生线虫成熟度指数(PPI)显著降低，土壤健康状况逐渐变好，小麦产量会随之逐渐增加；Spearman相关性分析结果显示，土壤线虫生态指标与土壤肥力和小麦产量及其构成之间具有显著相关性，其中土壤肥力综合评分IFI和小麦产量都与土壤线虫生态指标WI、H′、J′值显著正相关，与PPI值显著负相关。进一步说明采用香农多样性指数(H′)、均匀度指数(J′)、瓦斯乐斯卡指数(WI)和植物寄生线虫成熟度指数(PPI)可以表征出砂姜黑土的土壤健康状况。

4 结 论

1)长期不同施肥处理后的土壤肥力等级由高到低依次是：NPK+CM>NPK+PM>NPK+S>NPK>CK。其中，粪肥配施处理NPK+CM和NPK+PM的土壤肥力水平最高，秸秆配施NPK+S土壤肥力水平次之，单施化肥NPK肥力水平低于秸秆配施，不施肥处理CK肥力最低。

2)土壤线虫生态指标与土壤肥力水平和小麦产量密切相关。随着土壤肥力水平的提高，线虫香农多样性指数(H′)、均匀度指数(J′)和瓦斯乐斯卡指数(WI)显著提高，植物寄生线虫成熟度指数(PPI)显著降低，土壤健康状况显著提高。此时，NPK、NPK+S、NPK+PM、NPK+CM的产量较CK分别提升了337.87%、396.14%、495.43%和534.24%，因此采用香农多样性指数(H′)、均匀度指数(J′)、瓦斯乐斯卡指数(WI)和植物寄生线虫成熟度指数(PPI)来表征砂姜黑土的土壤健康状况具有一定的可行性。

致谢

感谢安徽省农业科学院土壤肥料研究所提供的长期定位试验基地，感谢王道中老师、花可可老师在试验选点和样品采集中给予的帮助和支持。