牛miR-2439-5p的转录因子-miRNA-mRNA调控网络预测与组织表达谱分析

刘 爽 魏大为 李 芬 王兴平 罗仍卓么 蔡小艳 马 云

(宁夏大学 农学院/宁夏回族自治区反刍动物分子细胞育种重点实验室，银川 750021)

随着人们生活水平的不断提高，高品质牛肉是人们消费的主导方向，其供不应求。在我国，牛肉的供应以黄牛为主，但是我国黄牛的肌内脂肪(Intramuscular fat, IMF)含量低，与国外优秀的品种相比，仍有很大差距。如何提高黄牛的肉品质，提高市场占有量，是我国畜牧业亟待解决的关键问题。

肌内脂肪是一种高遗传力性状[1]，通过提高磷脂含量影响风味、提高保水能力影响多汁性、降低剪切力影响嫩度，决定了牛肉的品级和价格。肌内脂肪沉积是一个复杂的生物过程，每一步均受基因的精准调控，据统计有900多个基因调控肌内脂肪含量[2]。miRNA对肌内脂肪沉积起重要调控作用，研究其调控机制，有利于揭示产肉性状的分子机制，为肉牛遗传改良提供理论基础。

miRNA是物种进化的主要动力之一，miR-2439-5p在2009年首次被发现，并命名为牛特异性miRNA，但其功能未知[3]。先前的研究表明，内含子miRNA通常与它们的宿主基因一起转录，并且可以对其宿主基因发挥协同和拮抗的调节作用[4]。miR-2439-5p位于牛MRTFA(Myocardin related transcription factor A，心肌素相关转录因子A)基因的内含子区域，研究表明，MRTFA是决定祖细胞向脂肪细胞生成的关键因素之一，MRTFA基因的缺失增加了脂肪生成[5-6]。但miR-2439-5p是否反馈调节其宿主基因MRTFA，从而调控牛脂肪细胞分化的功能和作用机制尚不明确。

1 材料与方法

1.1 查询miR-2439-5p在牛基因组上的位置

根据NCBI数据库(https:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/)提供的牛参考基因组序列(ARS-UCD1.2或bosTau9)和注释信息，查找miR-2439-5p在牛基因组上的位置。

1.2 生物信息学分析方法

使用Reciprocal BLAST定位前体序列bta-mir-2439到牛、人、小鼠、大鼠、狗、猪、马、绵羊、山羊和鸡等动物基因组；使用miRbase BLAST(http:∥www.mirbase.org/search.shtml)并对前体序列bta-mir-2439和加工成熟序列miR-2439-5p进行物种间保守性分析；确定在其他物种中没有检测到miR-2439-5p的直向同源物的成熟miRNA。

使用NCBI数据库获得前体序列bta-mir-2439和宿主基因MRTFA的上游序列(2kb)，并使用GPMiner软件(http:∥gpminer.mbc.nctu.edu.tw/index.php)和EMBOSS Cpgplot软件(https:∥www.ebi.ac.uk/Tools/seqstats/emboss_cpgplot/)进行CpG岛分析，然后使用Promoter 2.0(http：∥www.cbs.dtu.dk/services/Promoter/)和Neural Network Promoter Prediction(http:∥fruitfly.org:9005/seq_tools/promoter.html)启动子区域分析软件来预测启动子区域，最后PROMO软件(http:∥alggen.lsi.upc.es/cgi-bin/promo_v3/promo/promoinit.cgi?dirDB=TF_8.3)预测启动子区域潜在的转录因子结合位点。

使用TargetScan数据库(http:∥www.targetscan.org/vert_72/)和miRWalk数据库(http:∥mirwalk.umm.uni-heidelberg.de/)预测miR-2439-5p的靶基因，并用DAVID软件(https:∥david.ncifcrf.gov/)对靶基因进行GO分析和KEGG分析。

1.3 miR-2439-5p的组织表达谱分析

采集3头28月龄的郏县红牛的心、肝、脾、肺、肾、肌肉、背脂组织；采集3头28月龄和牛的心、肝、脾、肺、背脂组织；采集3头28月龄固原黄牛的心、肝、脾、肺、肾、肌肉、背脂和肾周脂组织，快速用手术剪分离成黄豆大小放入冻存管投入到液氮罐中，带回实验室冻存于-80 ℃冰箱，备用。

根据RT-PCR颈环引物设计原理，并结合miRbase数据库上miR-2439-5p序列，设计其特异茎环引物及荧光定量引物，并以U6作为内参基因。引物合引物设计详见表1，引物由安徽通用生物有限公司合成。

表1 本研究用到的引物信息Table 1 Information of primers in the study

1.4 数据分析

运用2-ΔΔCt法对试验数据进行分析， SPSS 22.0软件对miR-2439-5p表达量进行单因素方差(One-way ANOVA)分析，P<0.05表示差异显著，P<0.01表示差异极显著,P>0.05表示差异不显著。

2 结果与分析

2.1 miR-2439-5p在牛基因组的位置分析

由图1所示，miR-2439-5p位于牛5号染色体的反义链，牛MRTFA基因第三内含子，范围111 845 903至111 845 924，属内含子miRNA，宿主基因是MRTFA。前体序列bta-mir-2439的5’端臂和3’端臂均能加工产生2个成熟miRNA，分别为miR-2439-5p和miR-2439-3p。

将图书馆总分馆制建设督查评估纳入本地区公共文化服务考核指标。区文化部门负责对本区下辖街镇分馆和居村等各类服务点建设及运行情况进行评估考核。以落实意识形态工作责任制为要求，纳入街镇文化管理工作考核。并逐步引入第三方开展公众满意度测评，完善社会评价体系。认真对照服务标准，针对本地本单位实际，找缺补差，提能提效。

2.2 miR-2439-5p的物种间保守性分析

使用Reciprocal BLAST检测牛、人、小鼠、大鼠、狗、猪、马、绵羊、山羊、和鸡等动物基因组是否存在前体序列bta-mir-2439直系同源物，仅在牛基因组定位到bta-mir-2439序列。使用miRbase Blast搜索各物种bta-mir-2439相似序列，在其他物种未发现其高度相似序列，表明bta-mir-2439是牛特异性microRNA前体分子之一(表2)。同样，miR-2439-5p不存在与其他物种miRNA高度相似序列，miR-2439-5p是牛特异性miRNA(表3)。

图1 miR-2439-5p在牛基因组位置示意图Fig.1 Mapping of miR-2439-5p in bovine genome

表2 bta-mir-2439与各物种前体miRNA的比对Table 2 Alignment of bta-mir-2439 to precursor miRNAs of various species

表3 miR-2439-5p与各物种成熟miRNA的比对Table 3 Alignment of miR-2439-5p to mature miRNAs of various species

2.3 miR-2439-5p上游序列CpG岛分析

如图2(a)所示，bta-mir-2439上游序列(2 kb)不存在CpG岛，提示其启动子不是典型的GC-rich启动子或是可能主要依靠宿主基因MRTFA转录生成。

如图2(b)所示，GPMiner软件分析显示，牛MRTFA基因上游序列(2 kb)的CpG岛位于上游序列705～2 000 bp；EMBOSS Cpgplot软件分析显示，其CpG岛位于上游序列1 693～1 942 bp。GPMiner软件预测的CpG岛位置与人MRTFA基因启动子多处序列同源(表4)，进一步证实牛MRTFA基因上游序列(2 kb)的CpG岛位置存在启动子区域。

2.4 miR-2439-5p的启动子预测

软件Promoter 2.0预测结果(表5)：bta-mir-2439上游序列(2 kb)存在3个转录起始位点(Transcriptional start site, TSS)，900 bp处预测得分最高，为0.739。软件Neural Network Promoter Prediction预测结果(表6)：同样预测得到3个启动子，上游区域89～139预测的启动子得分最高，为0.97。综合结果，bta-mir-2439上游序列1 273 bp处是TSS，启动子范围为773～1 223 bp。

软件Promoter 2.0预测结果(表7)：牛MRTFA基因上游序列(2 kb)的600 bp处存在转录起始位点(TSS)，预测得分为0.505，预测结果可信度低(Marginal prediction)。软件Neural Network Promoter Prediction预测结果(表8)：预测得到1 545～1 595 bp、1 702～1 752 bp和1 710～1 760 bp 启动子区域。综合CpG岛预测结果，牛MRTFA基因上游序列1 751 bp处是TSS，启动子区域范围为1 251～1 801 bp。

(a)bta-mir-2439上游序列CpG岛分析；(b)牛MRTFA基因上游序列CpG岛分析 (a) CpG island analysis of upstream sequence of bta-mir-2439; (b) CpG island analysis of upstream sequence of bovine MRTFA gene图2 CpG岛分析图谱Fig.2 CpG island analysis map

表4 牛MRTFA基因启动子序列与Ensembl已知人MRTFA基因 启动子序列(-2 000～第一外显子端)比对分析Table 4 Alignment analysis of bovine MRTFA gene promoter sequences to Ensembl known human MRTFA gene promoter sequences (-2 000-first exon end)

表5 bta-mir-2439的Promoter预测Table 5 Promoter predictions of the bta-mir-2439 by Promoter 2.0

2.5 miR-2439-5p的转录因子预测

使用软件PROMO预测miR-2439-5p启动子的转录因子结合位点，设置参数差异(Dissimilar)小于0。结果显示，miR-2439-5p启动子共有8个C/EBPβ转录因子结合位点、2个RARα转录因子结合位点和1个AP-2α转录因子结合位点等。

牛MRTFA基因启动子共有6个C/EBPβ转录因子结合位点和1个RARα转录因子结合位点等。

表6 bta-mir-2439 NNPP预测Table 6 Promoter predictions of the bta-mir-2439 using NNPP

表7 牛MRTFA Promoter预测Table 7 Promoter predictions of bovine MRTFA by Promoter 2.0

2.6 miR-2439-5p的靶基因预测、GO分析和KEGG分析

TargetScanHuman 7.2数据库共预测出3 232个靶基因；miRWalk 2.0数据库共预测出1 185个靶基因；2个数据库预测交集靶基因共621个(图3(a))。通过对交集靶基因进行GO富集分析(图4)可知的靶基因显著富集在激素分泌负调节、长链脂肪酸生物合成和胰岛素应答等多个生物学过程，作用的位置主要在受体复合物和细胞质囊泡中，发挥转录辅助因子活性和核心启动子结合的分子作用。其中生物学过程中的激素分泌负调节、长链脂肪酸生物合成和胰岛素应答条目下的基因可能会对脂肪细胞分化和代谢产生影响。

表8 牛MRTFA NNPP预测Table 8 Promoter predictions of bovine MRTFA by NNPP

为了探究miR-2439-5p的生物学功能，本研究在GO分析的基础上，利用已有生物通路数据对交集靶基因进行了KEGG富集分析。结果显示，靶基因显著富集的信号通路中，mTOR信号通路、MAPK信号通路、AMPK信号通路、TGF-β信号通路、胰岛素抵抗信号通路、Hippo信号通路、脂肪细胞分泌因子信号通路和不饱和脂肪酸生物合成信号通路调控牛脂肪细胞分化和代谢(图3(b))。

2.7 miR-2439-5p的组织表达谱分析

miRbase数据库显示，miR-2439-5p和miR-2439-3p深度测序表达丰度分别为7 reads(4 experiments)和44 reads(3 experiments)。二者表达丰富度均偏低，依据目前对miRNA和miRNA*的定义[7]，miRNA和miRNA*同时产生，miR-2439-3p测序丰度较高，属于miRNA；miR-2439-5p测序丰度较低，属于miRNA*。miRNA*易被降解、在体内远小于miRNA的积累水平，但有其特殊使命。

由图5(a)所示，测序结果表明，miR-2439-5p在郏县红牛心、脾、肺、肾、肌肉和背脂组织均有表达，而在肝脏组织中不表达。其在肾组织中相对高表达，与肌肉和背脂组织存在显著性差异(P<0.01)。

由图5(b)和图5(c)所示，使用TAKARA公司荧光定量PCR试剂盒检测miR-2439-5p在和牛、固原黄牛各组织中的表达差异，结果显示：miR-2439-5p在和牛各组织广泛表达，在心、肺和背脂高表达，在背脂中表达量最高，与肝和脾的表达量有显著性差异(P<0.05)；miR-2439-5p同样在固原黄牛各组织广泛表达，但各组织表达量无显著性差异(P>0.05)。

(a)miR-2439-5p靶基因预测；(b)miR-2439-5p靶基因KEGG分析 (a) miR-2439-5p target genes prediction; (b) KEGG analysis of miR-2439-5p target genes图3 miRNA-2439-5p下游调控网络的生物信息学分析Fig.3 Bioinformatics analysis of downstream regulatory networks of miRNA-2439-5p

3 讨 论

从进化的角度看，大多数miRNA在不同动物之间高度保守，但仍存在少数动物物种特异性miRNA。本研究通过对miR-2439-5p进行物种间保守性分析，发现miR-2439-5p是牛特异性miRNA。miRNA以其快速的进化动力学而闻名，调控动物体内30%基因的表达，miR-2439-5p的出现可能会影响数百种基因的表达，加速了牛的进化过程。

哺乳动物约有50%的miRNA属于内含子miRNA(Intergenic miRNA)[8]，本研究确定miR-2439-5p在牛基因组上的位置，发现miR-2439-5p是内含子miRNA，宿主基因是MRTFA。研究表明，MRTFA是决定祖细胞向脂肪细胞生成的关键因素之一，MRTFA基因的缺失增加了脂肪生成[5-6]。内含子miRNA通常协同/拮抗宿主基因发挥生物学功能[9]，因此推断，miR-2439-5p可能反馈调控宿主基因MRTFA，抑制或促进牛脂肪细胞分化。

内含子miRNA一般随宿主基因共同转录，共享相同的启动子和调节元件[10]。CpG岛主要位于基因的外显子区域和启动子(Promoter)区域，是鉴别启动子区域的重要条件之一。本研究发现，牛MRTFA基因启动子区域存在CpG岛，并与已知人MRTFA基因启动子存在同源性。因此，miR-2439-5p可能同宿主基因MRTFA共享启动子元件。miR-2439-5p的上游序列不存在明显CpG岛区域，表明牛MRTFA基因可能更容易被转录激活。但也有研究者发现，内含子miRNA也有自己独立的启动子，不依靠宿主基因独自转录[11]。鉴于miR-2439-5p上游含有丰富的碱基序列，极有可能拥有独立的启动子区域，提示miR-2439-5p的启动子不是典型的GC-rich启动子。使用NNPP软件和Promoter2.0进一步提高启动子预测结果准确性，结合文献报告核心启动子区域在TSS上游500 bp、下游50 bp[12]，本研究预测牛MTRFA基因上游1 751 bp处为TSS，启动子区域为上游1 251～1 801 bp。miR-2439-5p上游1 273 bp处是TSS，启动子范围为773～1 323 bp。

筛选和鉴定miRNA及其靶基因是研究miRNA功能机制的关键一步。借助生物信息学方法可以对miRNA靶基因鉴定提供理论指导，对研究miRNA的功能机制有着重要指向作用。本研究使用TargetScanHuman 7.2数据库和miRWalk 2.0数据库筛选得到了miR-2439-5p的621个靶基因，显著富集的信号通路中，mTOR信号通路、MAPK信号通路和AMPK信号通路能够促进脂肪合成、脂肪细胞分化及影响脂肪细胞稳定[13-15]；TGF-β信号通路和Hippo信号通路能够抑制成熟脂肪细胞的生成[16-17]；胰岛素抵抗信号通路、脂肪细胞分泌因子信号通路和不饱和脂肪酸生物合成信号通路参与脂肪细胞的代谢和应答[18-19]。

(a)GO富集分析-生物学过程;(b)GO富集分析-分子功能;(c)GO富集分析细胞组分 (a) GO-Analysis-BP(Biological process); (b) GO-Analysis-MF(Molecular function); (c) GO-Analysis-CC(Cellular component)图4 miRNA-2439-5p靶基因GO富集分析Fig.4 GO enrichment analysis of miRNA-2439-5p target genes

图5 miR-2439-5p在郏县红牛(a)、和牛(b)和固原黄牛(c)各组织表达谱Fig.5 Expression difference of miR-2439-5p in different tissues in Jiaxian Red cattle (a), Wagyu (b) and Guyuan cattle (c)

此外，分析miRNA在不同组织的相对表达量有助于进一步探究其生物学功能[20]。本研究发现miR-2439-5p在和牛的背脂中表达量最高，与肝和脾的表达量有显著性差异(P<0.05)，表明miR-2439-5p可能调控牛脂肪沉积。

4 结 论

miR-2439-5p是牛特异性miRNA、内含子miRNA和miRNA*(相对低表达miRNA)。miR-2439-5p上游可能受C/EBPβ和RARα等转录因子调控，既可能同宿主基因MRTFA共享启动子元件，也可能拥有独立的启动子区域。miR-2439-5p下游可能通过mTOR信号通路、MAPK信号通路、AMPK信号通路、TGF-β信号通路、胰岛素抵抗信号通路、Hippo信号通路、脂肪细胞分泌因子信号通路和不饱和脂肪酸生物合成信号通路等，反馈调节其宿主基因MRTFA，从而调控牛脂肪细胞分化与代谢。miR-2439-5p在郏县红牛、和牛和固原黄牛的心、脾、肺、背脂组织均有表达，但在体内积累水平较低，其特殊的生物学功能有待进一步研究。