烟酰胺对甘蔗锰毒的缓解效应

覃美 肖京林 王晓霞 凌桂芝 唐新莲 黎晓峰

摘  要：本文揭示锰毒胁迫下甘蔗根分泌烟酰胺及其作用，为解决甘蔗锰毒问题提供依据。采用液质联用技术分离、鉴定甘蔗分泌物中的烟酰胺;采用水培试验方法，在培养液中添加烟酰胺研究烟酰胺对锰毒引起的甘蔗根伸长、胼胝质和活性氧积累及其相关酶活性等的影响。结果液质联用质谱图上显示，甘蔗根系分泌物中存在烟酰胺质谱峰，且锰胁迫条件下烟酰胺信号更强;锰毒胁迫下甘蔗根系伸长受阻、根系活力降低，根尖积累胼胝质，根系中过氧化氢、活性氧及丙二醛含量和超氧化歧化酶、氧化氢酶、抗坏血酸氧化物酶活性显著提高;在锰胁迫下添加于培养液中的烟酰胺显著降低或消除锰的上述影响。可见，过多的锰诱导甘蔗根系分泌烟酰胺，而烟酰胺显著抑制过多的锰对甘蔗生长及过氧化胁迫伤害。

关键词：甘蔗;锰毒;烟酰胺;作用

中图分类号：S566.1      文献标识码：A

Abstract： This study revealed the secretion of nicotinamide from sugarcane roots under the stress of manganese toxicity and its role， and provided a basis for solving the problem of manganese toxicity in sugarcane. The liquid-mass spectrometry was used to isolate and identify nicotinamide in sugarcane exudates. The effects of nicotinamide on root elongation， callose and reactive oxygen species accumulation， and related enzyme activity of sugarcane induced by manganese toxicity were studied by hydroponic experiments. There were nicotinamide mass spectrum peaks in sugarcane root exudates， and the nicotinamide signal was stronger under manganese stress. Under the stress， the root elongation of sugarcane was blocked and the root activity decreased， while the root tip accumulated callose， the contents of hydrogen peroxide， reactive oxygen species and malondialdehyde and the activity of superoxide dismutase， oxidase and ascorbate oxidase in the roots were significantly increased. Nicotinamide added to culture medium under manganese stress significantly reduced or eliminated the above effects of manganese. It can be seen that excessive manganese induces the secretion of nicotinamide from sugarcane roots， and nicotinamide significantly inhibits the damage of excessive manganese to sugarcane growth and peroxide stress.

Keywords： sugarcane; manganese toxicity; nicotinamide; effect

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.11.036

錳是成土矿物的成分，土壤中锰多以难溶性矿物态存在，但在酸性等条件下大量的锰溶解到土壤溶液中。植物吸收积累过多的锰后，植物酶系统和功能受到干扰，植物代谢紊乱，正常生长受阻[1-3];形成并积累大量的活性氧，导致膜脂过氧化，多酚氧化形成褐色的醌类物质，叶片组织形成褐斑坏死[2， 4];抑制叶绿素的合成，加速叶绿素的分解，破坏叶绿体结构，光合受阻，叶片黄化[5-7]。因此，锰毒是酸性土壤中作物生长的主要限制因子。甘蔗是我国主要的糖料作物，对我国食糖安全至关重要。本课题组在前期研究发现，华南地区酸性土壤上的甘蔗近年来发生严重的锰毒黄化问题，锰毒已成为制约我国甘蔗生产的主要问题之一[1， 5-7]。

烟酰胺是烟酸的酰胺化合物，作为辅酶Ⅰ和辅酶Ⅱ的组成部分，参与各种细胞的代谢过程。烟酰胺（NIC）也是一种天然的抗氧化剂，可以清除自由基，提高植物抗逆性。有研究结果表明，营养液中添加烟酰胺能够促进植物的生长，提高根系活力[8]。外源烟酰胺改善苜蓿、蚕豆对盐胁迫的适应性[9]。最近，Sędzik[10]研究发现，根系分泌的烟酰胺在减轻大麦铅毒害方面发挥重要作用。然而，作为重要作物，在锰胁迫下甘蔗根系是否分泌烟酰胺？烟酰胺在缓解甘蔗锰毒方面是否有积极作用？据查阅文献，有关锰诱导根系分泌烟酰胺的相关研究尚未见报道。因此，本研究对锰胁迫甘蔗根系分泌烟酰胺及其对甘蔗锰毒的影响进行了探讨，旨在为烟酰胺在锰毒作物上的应用及甘蔗育种上提供科学依据。

1  材料与方法

1.1  材料

试验甘蔗品种为‘中蔗1号’。供试材料参照武欣等[11]的方法在温室中育苗，做以下研究的试验材料。根据课题组前人研究，当锰胁迫达0.1 mmol/L时，甘蔗的生物产量已经显著下降，叶绿素含量显著下降，叶片显著发生黄化作用[7，12]。

为收集甘蔗根系分泌物，以已经长至1心4叶的25日龄的幼苗为试验处理材料，将供试幼苗分别在含0（CK）和0.1 mmol/L MnCl2（Mn）的基础培养液中培养，每个处理3个重复，一个重复4株甘蔗幼苗。基础培养液为1/5强度的Hogland营养液，pH 5.5（下同）。2 d后，将营养液更换成用去离子水浸洗根系，反复3～5次。最后，将幼苗转移至去离子水培养。4 h后，收集含根系分泌物的溶液，于旋转蒸发仪浓缩至干。加水溶解浓缩瓶中浓缩物，收集溶解溶液，保存于‒20 ℃冰箱并采用液质联用分析其中的烟酰胺。根系烘干、称重。

为研究烟酰胺对锰引起的膜脂氧化的影响，以已经长至1心4叶的25日龄的幼苗為试验处理材料，特设置以下处理：0（CK）、0.1 mmol/L MnCl2（Mn）、0.1 mmol/L Mn+0.1 mmol/L烟酰胺（分析纯，购于索莱宝）（Mn+NIC），培养甘蔗幼苗。每个处理设置3个重复，一个重复4株甘蔗幼苗。2 d后，采集+1叶和根系样品，采用以下方法分别测定酶活和膜脂过氧化指标。

为探究锰胁迫处理甘蔗根生长的影响，选取7 d日龄、初生根长势均匀的种茎在溶液的4 L塑料容器中培养。每个种茎记的幼苗为一个重复，每个处理设置12个重复。分别培养在CK、Mn和Mn+NIC处理溶液中。2 d分别测定出生根长度，根系活力、观察胼胝质积累。

1.2  方法

烟酰胺：三重四级杆-液质联用法[13]。色谱条件：色谱柱：Waters ACQUITY UPLC HSS T3（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）。柱温：40 ℃。流速：0.3 mL/min。进样量：2 μL。流动相A：0.1%甲酸水;流动相B：甲醇。质谱条件：离子源（105 ℃）：电喷雾离子源;扫描方式：多反应监测（MRM）正离子模式;气体温度：495 ℃;气体流速：300 L/h。烟酰胺监测离子对及质谱参数见表1。

酶活性：取待测0.5 g加入4 mL磷酸缓冲液 （50 mmol/L，pH 7.8，含1 mmol/L EDTA和2%聚乙烯吡咯烷酮）研磨成匀浆，在10 000 r/min低温（4 ℃）离心20 min，上清液用于超氧化物歧化酶（SOD，淡蓝四唑法）、氧化氢酶活性（CAT，过氧化氢紫外线法）、抗坏血酸氧化物酶（APX）活性测定[14]。

过氧化氢（H2O2）含量：采用硫酸钛法测定[14]。

超氧阴离子（O2.‒）含量：采用羟胺氧化法测定[14]。

丙二醛含量：硫代巴比妥酸（TBA）比色法[14]。

根系活力测定：氯化三苯基四氮唑（TTC）法测定[14]。

根伸长率：处理前后分别用直尺测量初生根长，计算相对伸长率：（处理后根长-处理前根长）÷ 处理后根长×100%。

根尖细胞对伊文思蓝的透性：切取0～1 cm根尖，于0.1%的伊文思蓝溶液中染色30 min后，用蒸馏水冲洗根5遍以去除过量的染料。以吸水纸吸干根表面水分后，准确称取0.2 g于含1%十二烷基磺酸钠和50%甲醇溶液中、50 ℃下浸提根中的伊文思蓝。30 min后，吸取提取液，于600 nm下检测OD值，并计算单位重量的根中伊文思蓝的量。

胼胝质：参照丁新伦等[15]的方法稍加修改。处理结束的根尖放入FAA固定液（含10%甲醛、5%冰乙酸、45%乙醇）中固定24 h，固定结束后取出并放置于装有磷酸缓冲液（0.05 mol/L，pH 8.5）的离心管中软化30 min，用0.1%苯胺蓝（溶于0.05 mol/L的磷酸缓冲液，pH 8.5）染色30 min于全自动正置微分干涉荧光显微镜（Axio Image A2，蔡司公司，德国）观察、拍照。显微镜选择503通道紫外激发光观察。

1.3  数据处理

数据差异性采用邓肯法进行分析。

2  结果与分析

2.1  锰诱导甘蔗根分泌烟酰胺

采用液质联用仪分析烟酰胺标准品后，通过表1中质谱条件和烟酰胺离子对123/80、123/53、定性离子片段80进行定量分析，可以在此条件下可定性定量检测烟酰胺。检测器上可观察到烟酰胺标准品保留时间为1.98 min的吸收峰（图1A）。将根系分泌物收集、浓缩后，在相同条件下进行分离，检测器上也出现保留时间1.98 min与烟酰胺相同的质谱峰，说明甘蔗根分泌烟酰胺。

甘蔗根系经0.1 mmol/L MnCl2（Mn）溶液中处理48 h后，根分泌的烟酰胺质谱峰明显高于对照（CK，不加Mn）。通过定量分析结果显示，锰处理的根系分泌烟酰胺显著高于对照，达对照处理的2.61倍（图1B）。这些结果说明，锰毒胁迫可诱导甘蔗根系分泌烟酰胺。

2.2  烟酰胺对根伸长、活力、细胞力和胼胝质积累的影响

根是最先接触生长介质中有害元素的植物器官，对有害元素的反应敏感。因此，根伸长及根尖活力是敏感性指标，常用于评价元素对植物毒性的强弱。研究发现锰胁迫条件下甘蔗根伸长显著受阻，根伸长率仅相当于对照的75.5%（图2A）。然而，在Mn溶液中添加烟酰胺后根伸长率显著提升，并恢复至CK相当的水平。与此相似，锰胁迫条件下根的活力显著下降，而在Mn溶液中添加烟酰胺后根系活力显著增加（图2B）。这些结果表明，根分泌的烟酰胺能有效缓解锰对甘蔗的毒害。

伊文思蓝是检测细胞膜完整性和细胞活力的染料，由于分子量（960.8）大，其并不能透过细胞膜进入活体细胞。只有在细胞活力降低、细胞膜损伤后，伊文思蓝方能顺利进入细胞并与胞内蛋白质结合形成具有蓝色荧光的复合物。因此，伊文思蓝染色法是鉴定植物细胞活力的有效方法。研究发现，锰处理后的根尖经伊文思蓝染色后，根尖细胞中积累的伊文思蓝显著增加，说明过多的锰引起根尖细胞死亡（图3A）。然而，Mn溶液中添加烟酰胺（Mn+NIC）后，根尖细胞中积累的伊文思蓝（297.3 mg/kg）仅仅相当于Mn处理的67.8%。这些结果说明，根分泌的烟酰胺能缓解锰引起根尖细胞死亡。

胼胝质积累是锰毒害的重要标志[16]。胼胝质定位于胞间连丝等上。沉积在胞间连丝上的胼胝质能够调节胞间连丝的渗透性，阻塞胞间水分、养分和信号分子等的运输。胼胝质与苯胺蓝反应后形成特定的荧光色素。在锰毒胁迫条件下，苯胺蓝染色后根尖表面可观察明显的荧光，而对照（CK）的荧光强度很弱（图3B），说明Mn诱导甘蔗根尖胼胝质沉积。然而，锰溶液中的烟酰胺使根尖胼胝质积累量降低，使根尖荧光强度明显变弱。这些结果进一步说明，根分泌的烟酰胺能缓解甘蔗锰毒害。

2.3  烟酰胺对丙二醛、过氧化氢以及超氧阴离子积累的影响

丙二醛是膜脂过氧化作用的产物之一，能直接反映生物膜受损程度。通过测定根中丙二醛含量，可以探讨锰毒对根系膜脂过氧化的影响。在Mn胁迫下，根中丙二醛积累显著增加，说明锰胁迫破坏了根系细胞的正常生长，当营养液中存在烟酰胺时（Mn+NIC），丙二醛积累显著下降（图4），说明烟酰胺能够缓解锰胁迫所引起的膜脂过氧化影响，缓解锰的毒害。

过氧化氢、超氧阴离子是植物中重要的过氧化剂，其过多积累会引起膜脂过氧化、细胞受损进而导致细胞死亡。试验结果表明，Mn处理后甘蔗根中过氧化氢显著积累，而在烟酰胺添加的情况下（Mn+NIC）根中过氧化氢含量显著降低。

与此相似，Mn诱导根中超氧阴离子显著积累，而Mn+NIC处理使超氧阴离子积累量降低，甚至低于对照的积累水平。这些结果说明，烟酰胺能消除过多锰毒条件下膜脂过氧化胁迫伤害。

2.4  烟酰胺对抗氧化酶活性的影响

过氧化氢酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）、抗坏血酸过氧化物酶（APX）是植物体内清除活性氧保护机制中的重要成员，受氧化胁迫诱导。由表3可知，Mn胁迫条件下根中这些抗氧化酶活性均显著增加，说明锰胁迫激活甘蔗根系抗氧化酶。当营养液中存在烟酰胺时（Mn+NIC），CAT、SOD和APX活性均显著增加。烟酰胺处理后，CAT和SOD活性恢复到对照处理相当的水平，而APX活性则显著高于对照水平。这些结果进一步说明，烟酰胺能降低锰毒引起的过氧化胁迫。

3  讨论

锰毒是酸性土壤中抑制作物生长的主要元素之一。过多的锰造成华南地区酸性土壤上的甘蔗发生大面积的黄化问题，锰毒已成为限制我国食糖安全的重大问题[1， 5-7]。在长期的生物进化过程中，一些植物获得了抵御过多锰的环境的一些机制。这些机制包括分泌能螯合锰的有机酸、碱化根际、提升根际Eh等降低土壤中锰的毒性。例如，早在2009年Mora等[17]的研究就发现，锰毒胁迫下耐锰的黑麦草就通过根分泌柠檬酸适应锰过多的环境。本研究发现锰毒胁迫下甘蔗根系分泌烟酰胺。

Abdelhamid[18]在探究烟酰胺对盐胁迫条件下蚕豆幼苗生长试验发现，烟酰胺能够缓解盐胁迫，并促进幼苗生长。本研究发现，烟酰胺能减轻锰对甘蔗的毒害。锰胁迫条件下甘蔗根尖细胞死亡数量增加、根伸长受阻、根系活力下降。营养液中存在烟酰胺时，锰引起的细胞死亡减少、根伸长阻碍和根活力下降明显缓解。锰毒胁迫下根系分泌的烟酰胺的作用尚不清楚。

烟酰胺减轻重金属的毒害现象也发现在大麦铅毒害的研究中[10]：在0.5 mmol/L PbNO3 溶液中的尼克酰胺（25～100 μmol/L）显著降低铅离子对根生长、植株生物产量的不良影响而增加大麦对铅毒害的抗性指数。在水曲柳的研究中，Kalbin等[19]也发现烟酰胺能提高植物对Cd、Cu、Zn等重金属毒害的抗性。烟酰胺也有效减少盐胁迫对蚕豆伤害，改善植物光合作用、植株生长及光合产物的积累[18]。本研究还发现，锰胁迫引起植物中超氧阴离子、过氧化氢等活性氧的积累，诱发细胞膜脂过氧化和丙二醛积累。当营养液中存在烟酰胺时，锰引起活性氧、过氧化酶及过氧化产物均显著降低。相关研究发现，烟酰胺也能减少Pb引起的MDA在植物组织中的积累和CAT的激活[10]。外源尼克酰胺也增加胡萝卜素等抗氧化物的积累并降低养分胁迫激活的过氧化酶、多酚氧化酶的活性和MDA的积累。尼克酰胺也能保护2，2-偶氮二（2-甲基丙基咪）二盐酸盐引起的过氧化对培养细胞伤害[20-23]。Smolik等[10]研究发现，高浓度的烟酰胺显著降低CAT活性，可能是烟酰胺的抗氧化性能和在铅胁迫中的作用表现为化合物能抑制铅的破坏作用，应用烟酰胺作为抗氧化剂，促进了普通大麦的根尖生长。

综上所述，锰对甘蔗的胁迫作用导致正常代谢活动遭受破坏，导致发生膜脂过氧化，大量积累活性氧、胼胝质，并加剧根尖细胞死亡而抑制根尖伸长，根系活力下降，根系正常生长受阻。在本研究中，锰胁迫条件下有烟酰胺的分泌，通过探究烟酰胺对锰毒缓解作用试验发现，烟酰胺能够减少锰脅迫导致的丙二醛和ROS的积累，提高了根系活力和细胞活力，促进根的伸长，而使抗氧化酶活性维持与CK处理相当。烟酰胺对甘蔗锰胁迫耐性的提高可能是表现为抗氧化剂功能而抑制锰对甘蔗正常生理的破坏作用，具体作用机制有待今后的研究证实。此外，烟酰胺作为辅酶的重要组成结构，参与新陈代谢过程，可能在调节锰胁迫条件下植物代谢和提高植物抗逆性方面具有潜在作用。

4  结论

锰毒胁迫下甘蔗根系能分泌烟酰胺;烟酰胺有利于增强甘蔗的抗氧化能力，减轻锰对甘蔗毒害。

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