蛇床子素对特异性皮炎小鼠皮肤屏障及慢性瘙痒的作用

陈姣蓉，洪小平，段妍君，张彦红，韩永明

(湖北中医药大学基础医学院解剖组胚教研室，湖北 武汉 430065)

特异性皮炎(atopic dermatitis，AD)为一种伴随严重瘙痒的炎症性皮肤病，其具有发病机制多、发病率高、病情易反复等特点。目前认为，遗传、环境、免疫及皮肤屏障的破坏参与了特异性皮炎的发生机制[1]。临床治疗从改善皮肤屏障和缓解皮肤搔抓次数为主要原则，但目前尚缺乏安全有效的药物，多采用保湿制剂或抗生素、激素类药物缓解症状[2]。随着对中药学研究的深入，发现许多止痒方剂在止痒上有重要价值，其中以蛇床子使用频率最高，甚至有研究发现蛇床子具有修复皮肤屏障的作用[3]。中医学中提到，蛇床子内外俱可施治，以外治尤良，具有抗炎、抗病毒、抗过敏等多种作用[4]。蛇床子在心肌梗死[5]、食管鳞癌[6]等多种疾病中参与抗炎、抗细胞凋亡作用，但关于蛇床子在特异性皮炎中是否发挥皮肤屏障保护的作用仍需要更多的研究数据来证实。聚丝蛋白和紧密连接蛋白是皮肤屏障中研究最多的对象，因此本研究通过小鼠实验来确定蛇床子对AD小鼠模型皮肤屏障和炎症的改善是否产生积极影响,以期为临床治疗提供新的策略依据。

1 材料

1.1 细胞株 人角质细胞(HaCaT细胞)，由中国医学科学院细胞库提供，在含10%胎牛血清AMEM培养基中、在37 ℃、5%CO2的条件下培养。

1.2 动物 无特定病原级的雄性BALB/c小鼠，6～8周龄，体质量20～30 g，购自湖北奥菲生物科技有限公司，实验动物生产许可证号SCXK(鄂)2019-0024，动物实验批准号IACUC20190306，于湖北中医药大学实验动物研究中心完成实验，实验环境为温度(20±2)℃，相对湿度45%～50%，12 h/12 h明暗交替，自由摄食饮水。

1.3 试剂与药物 噁唑酮液配制方法为将80%丙酮和20%橄榄油混合物作为溶剂，与2%噁唑酮按一定比例混合，分别配制成0.5%、0.2%致敏液，4 ℃避光保存。蛇床子素(纯度≥98%，美国Clontech公司)，在4 ℃冰箱中避光保存。p-Akt激动剂SC79(纯度98%，上海沪震实业有限公司)，取3.65 mg SC79加入10% DMSO溶液和90%玉米油1 mL配制成10 mmol/L溶液。噁唑酮、橄榄油、丙酮(深圳市瑞沃德生命科技有限公司，质量分数>50%)；10%胎牛血清、PBS溶液(四川讯麦科技有限公司)；RNA提取试剂盒(北京庄盟国际生物基因科技有限公司)；TaKaRa反转录试剂盒、p-Akt一抗、p-Erk一抗(日本TaKaRa公司)；4%多聚甲醛(北京索莱宝科技有限公司)；RIPA蛋白裂解液(上海艾研生物科技有限公司)。

1.4 仪器 实时荧光定量PCR仪(德国Leica公司)；WJ-3-160T型CO2培养箱(上海新诺仪器设备有限公司)；荧光显微镜(美国ABI公司)；索尼A7M3高清相机(日本SONY公司)。

2 方法

2.1 分组与造模 30只小鼠随机分为空白组、AD组(模型组，激动剂组，蛇床子素低、高剂量组)，每组6只，实验前1 d剃毛刀除去背部毛发，确定皮损区域面积约为2 cm×4 cm，适应3 d。第4天，空白组小鼠背部剃毛部位均匀涂抹溶剂150 μL致敏，AD组小鼠均匀涂抹0.5%噁唑酮液150 μL致敏，每组2次。第5天，空白组小鼠取溶剂50、20 μL分别均匀涂抹于背部和右侧耳部，AD组小鼠取0.2%噁唑酮液50、20 μL分别均匀涂抹于背部和右侧耳部，适应2 d。第7天，空白组小鼠不作其他处理，激动剂组小鼠腹腔注射50 mg/kg p-Akt激动剂SC79，模型组小鼠注射蒸馏水30 mg，蛇床子素低、高剂量组小鼠分别腹腔注射提取物0.3、0.9 mg，此后每48 h注射1次(第11、14天)，最后第21、28天分别刺激1次(空白组小鼠取溶剂50、20 μL，AD组小鼠取0.2%噁唑酮液50、20 μL均匀涂抹于背部和右侧耳部)以维持皮损持续存在。第29天进行背部皮损严重程度评分，测定搔抓次数，采集血清后处死小鼠，留取皮损组织标本并分为3份，1份置于冻存管中加入一定量的Trizol，完全浸泡皮肤组织，-80 ℃保存，用于RT-qPCR检测；另外2份常温保存于10%甲醛中，用于病理及免疫组化检测。

2.2 皮损评分、搔抓次数测定 肉眼观察并记录小鼠背部及耳部皮损症状，采用皮损严重程度评分进行评价，包括红斑、渗出、脱屑、苔藓样变，0～3分分别表示无皮疹、轻度皮疹、中度皮疹、重度皮疹。实验结束后，记录每只小鼠10 min内对自身耳部及背部的搔抓次数，连续搔抓计为1次。

2.3 RT-qPCR法检测紧密蛋白的mRNA表达 组织中加入1 mL Trizol，吹打混匀后转入1.5 mL EP管中，漩涡振荡器充分振荡，室温下放置5 min以使细胞充分裂解，加入氯仿200 μL，剧烈振荡15 s使其呈乳糜状，室温下静置3 min，分层后4 ℃、12 000 r/min离心15 min，吸取最上层清亮液体400 μL至1.5 mL DEPC处理过的EP管中，依次加入异丙醇400 μL、75%乙醇1 mL，4 ℃、12 000 r/min离心10 min，反复吹打使沉淀充分溶解，提取各组细胞总RNA，检测Cldn-1、Cldn6、Cldn-23、ZO-1、ZO-2、ZO-3、ZO-4 mRNA表达。

采用Takara反转录试剂盒将总RNA逆转录成cDNA，以其为模板进行PCR扩增，引物序列见表1，95 ℃预变性15 s，95 ℃变性5 s，60 ℃退火延伸30 s，循环45次。以GAPDH为内参，按照2-△△CT法计算组细胞中紧密连接蛋白mRNA表达。

表1 引物序列

2.4 Western blot检测PI3K/Akt通路蛋白表达 组织剪碎，加RIPA裂解液充分裂解后置于组织匀浆器中，10 000 r/min离心5 min，取总蛋白上样，电泳，切胶，转至PVDF膜上，选择湿转，TBS-T在25 ℃下封闭1 h，加入p-Akt一抗、p-ERK一抗(1∶500)、GAPDH一抗(1∶2 000)，4 ℃摇床过夜，PBST洗膜，加二抗(1∶2 000)，4 ℃摇床过夜，PBST洗膜，ECL发光试剂盒显色、显影，以GAPDH为内参蛋白，通过Image Quant TL软件分析各条带的灰度值。

3 结果

3.1 小鼠皮损评分、搔抓次数 模型组小鼠皮损评分、搔抓次数高于空白组(P<0.05)；与模型组比较，激动剂组，蛇床子素低、高剂量组小鼠皮损评分、搔抓次数均降低(P<0.05)，激动剂组小鼠皮损评分、搔抓次数高于蛇床子素低、高剂量组(P<0.05)，蛇床子素低剂量组皮损评分、搔抓次数高于蛇床子素高剂量组(P<0.05)，见表2。

表2 各组小鼠皮损评分、搔抓次数比较

3.2 小鼠紧密连接蛋白mRNA表达 与空白组比较，模型组小鼠Cldn-1、Cldn6、Cldn-23、ZO-1、ZO-2、ZO-3、ZO-4 mRNA表达降低(P<0.05)，Cldn-5、Cldn-15、JAM-1、JAM-2 mRNA表达升高(P<0.05)；与模型组比较，激动剂组，蛇床子素低、高剂量组小鼠Cldn-1、Cldn6、Cldn-23、ZO-1、ZO-2、ZO-3、ZO-4 mRNA表达升高(P<0.05)，Cldn-5、Cldn-15、JAM-1、JAM-2 mRNA表达降低(P<0.05)；蛇床子素低、高剂量组小鼠Cldn-1、Cldn6、Cldn-23、ZO-1、ZO-2、ZO-3、ZO-4 mRNA表达高于激动剂组，Cldn-5、Cldn-15、JAM-1、JAM-2 mRNA表达低于激动剂组(P<0.05)，见图1。

注：与空白组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05；与激动剂组比较，▲P<0.05。图1 各组小鼠紧密连接蛋白mRNA表达

3.3 小鼠PI3K相关蛋白表达 与空白组比较，模型组小鼠p-Akt蛋白条带信号增强，p-ERK蛋白条带信号无变化；与模型组比较，激动剂组，蛇床子素低、高剂量组小鼠p-Akt蛋白条带信号减弱，见图2。与空白组比较，模型组小鼠p-Akt表达升高(P<0.05)，激动剂组，蛇床子素低、高剂量组p-Akt表达低于模型组(P<0.05)，激动剂组p-Akt表达高于蛇床子素低、高剂量组(P<0.05)，蛇床子素低剂量组与蛇床子素高剂量组p-Akt表达差异无统计学意义(P>0.05)，空白组，模型组，激动剂组，蛇床子素低、高剂量组p-ERK表达差异无统计学意义(P>0.05)，见表3。

图2 各组PI3K相关蛋白表达

表3 各组PI3K相关蛋白表达比较

4 讨论

近年，聚丝蛋白和紧密蛋白在皮肤屏障中的作用研究较多，紧密蛋白位于皮肤屏障系统的中心位置，为皮肤屏障系统调节的关键环节，能够对刺激做出非常迅速的反应，其功能或水平的改变均可引起皮肤组织缺水、脱水、pH值异常及皮肤屏障功能破坏[7-8]。本研究中表现为皮肤屏障破坏和瘙痒相关症状，考虑小鼠缺乏紧密连接蛋白(Cldn、JAM、ZO)后，离子和大分子的细胞外渗透而出现皮肤屏障受损[9]。Cldn-1可影响角质层水屏障功能，参与大分子紧密连接屏障形成。Su等[10]指出，特异性皮炎患者皮肤中紧密连接蛋白Cldn-1、Cldn-6、Cldn-8、Cldn-19、Cldn-23下调，显著影响了皮肤紧密连接功能。特异性皮炎病灶皮肤汗腺Cldn-1下调，且Nattkemper等[11]证实了Cldn-1可预防汗腺渗漏。ZO-3仅在上皮细胞中表达，参与形成细胞间紧密连接，付莉慧等[12]发现ADF模型小鼠皮肤中ZO-3下调且参与细胞间紧密连接蛋白的形成。Akt信号通路和ERK信号通路与紧密连接蛋白表达相关，为探索AD小鼠模型中参与调节紧密连接蛋白表达的信号通路，取小鼠皮肤样本对p-Akt和p-ERK表达进行检测，结果AD模型小鼠皮肤中PI3K/Akt通路中的关键蛋白p-Akt上调而p-ERK无显著变化，提示PI3K/Akt信号通路与特异性皮炎发生相关，参与了人角质形成细胞间紧密连接的形成和AD皮肤平衡的破坏，这与胡雪勤[13]的报道结果一致。同时，激动剂组小鼠p-Akt的变化趋势与低剂量组、高剂量组一致，p-Akt激动剂可发挥改善紧密连接的作用。激动剂组小鼠抓痒次数和皮损评分较模型组小鼠得到显著改善，说明Akt信号通路参与调节AD模型小鼠瘙痒症状。

蛇床子素治疗后小鼠皮损程度和搔抓次数均得到显著改善，该变化随着药物的累积呈渐进式改善，且高剂量组小鼠的改善效果优于低剂量组。蛇床子素作用于小鼠后，其各连接蛋白mRNA表达异常下调，其中以ZO-3下调最明显；同时，蛇床子素的应用降低了p-Akt表达，且这种作用呈剂量依赖。本研究结果证实了蛇床子素对AD模型小鼠的皮肤屏障和慢性搔抓次数均有显著影响，其可改善AD小鼠皮肤屏障破坏，这与既往报道结果一致[14-16]。根据Yao等[14]的文献结果，这与蛇床子素介导了多种炎症因子有较大关系。孔亮等[15]指出，蛇床子素对开放性脑损伤的小鼠具有一定的治疗作用,可能是通过减少炎症细胞浸润和细胞凋亡发挥治疗作用。李晓婷等[16]报道，蛇床子素可直接作用于而产生抗炎作用。

综上所述，蛇床子素可通过介导PI3K/Akt通路调控AD小鼠模型皮肤中紧密连接蛋白表达，可改善皮肤屏障受损、减轻慢性搔抓次数，为特异性皮炎治疗提供了更有利的临床依据。