蓬莪术醋制前后总姜黄素的大鼠肠吸收动力学差异比较

高天慧，袁 涛，朱宗萍，廖 婉*，林美斯，任 波*

(1.西南特色中药资源国家重点实验室，成都中医药大学药学院，四川 成都 611137;2.成都市食品药品检验研究院，四川 成都 610045；3.成都中医药大学附属医院针灸学校，四川 成都 610097)

蓬莪术CurcumaphaeocaulisVal.是川产道地药材的代表性品种之一，也是2020年版《中国药典》收载的莪术主要来源之一[1]。具有行气破血、消积止痛之效，常用于治疗气滞血瘀所致的癥瘕积聚、经闭及心腹瘀痛等症。蓬莪术炮制最早记载于《雷公炮炙论》中，“凡使，于砂盆中用醋磨”，醋制后主入肝经血分，既能增 “破积消坚，去积聚癖块”之效，又可缓生品峻猛之性。课题组前期结果表明总姜黄素是蓬莪术的主要药效部位之一，其所含主要单体成分为双去甲氧基姜黄素、去甲氧基姜黄素及姜黄素[2]。经测定，醋制后的蓬莪术饮片中，双去甲氧基姜黄素、去甲氧基姜黄素及姜黄素分别由(0.081 5±0.003)、(1.083 5±0.014)、(0.683 0±0.004)mg/g增加至(0.187 0±0.003)、(3.858 5±0.032)、(5.953 5±0.046)mg/g[3]。进一步研究发现，醋制后的蓬莪术中，总姜黄素对TGF-β信号通路的调控能力进一步提高，从而增强了抗肝炎作用[4]，这表明总姜黄素可能是蓬莪术醋制“增效减毒”的重要物质基础之一。

蓬莪术最常用的给药方式为口服，而吸收为口服给药后确保药效发挥的关键环节之一，小肠是体内药物吸收的主要部位，在体肠灌注模型常用于研究口服药物肠道吸收情况[5-6]。故本实验以大鼠在体肠灌流模型为载体，开展蓬莪术醋制前后总姜黄素大鼠肠吸收差异研究。并将蓬莪术的另一大主要组分—挥发油[7]，与总姜黄素进行配伍，开展肠吸收研究，以期更全面合理地反映蓬莪术药效成分在大鼠体内肠吸收情况，对比分析蓬莪术醋制前后及组分配伍前后大鼠体内生理效应表达的过程性机制差异，以期进一步揭示蓬莪术“增效减毒”的科学内涵。

1 材料

LC-2030C3D型高效液相色谱仪(日本岛津公司)；UV756CRT型紫外可见分光光度计(上海佑科仪器仪表有限公司)。

双去甲氧基姜黄素(CAS 33171-05-0，批号140613)、去甲氧基姜黄素(CAS 24939-17-1，批号140815)、姜黄素(CAS 458-37-7，批号140612)均购于四川省维克奇生物科技有限公司，纯度≥98%；甲醇(色谱纯，批号WXBC8485V)、乙腈(色谱纯，批号WXBC9153V)，均购于美国Sigma-Aldrich公司；冰醋酸(色谱纯，批号2018060103，成都市科隆化学品有限公司)；水合氯醛(分析纯，批号2017030301)、苯酚红(分析纯，批号2017091801，成都市科隆化学品有限公司)。

蓬莪术采自道地产区四川省，经成都中医药大学中药标本中心卢先明教授鉴定为姜科植物蓬莪术CurcumaphaeocaulisVal.。按课题组前期蓬莪术醋制专利方法[8](专利号ZL 2013 1 0400255.2)炮制得醋莪术饮片，即取适量蓬莪术生品，加入30%量的9°米醋，拌匀闷润2 h，煮至醋液收干，于120 ℃下干燥30 min，取出稍冷，干燥即得醋莪术饮片[9]。

清洁级 SD大鼠，雄性，36只，体质量(300±25)g，由成都达硕实验动物有限公司提供，生产许可证编号为 SCXK(川)2015-030。

2 方法与结果

2.1 醋制前后蓬莪术挥发油及总姜黄素提取 分别取蓬莪术饮片(生品、醋品)，加入8倍量水，浸泡1 h后水蒸气蒸馏提取6 h，收集即得淡黄色具特殊气味的透明油状物质，加入适量无水硫酸钠脱水后离心2 min即得[10]。

提取挥发油后，过滤所得即为去油药渣。称取去油蓬莪术药渣(生品、醋品)，加入3倍量的950 mL/L乙醇，提取2次，每次2 h，滤液合并，减压浓缩至浸膏，即得总姜黄素[11]。生莪术总姜黄素浸膏中双去甲氧基姜黄素、去甲氧基姜黄素、姜黄素质量浓度分别为(1.030 0±0.046)、(9.810 5±0.130)、(10.628 5±0.211)mg/g，醋莪术总姜黄素浸膏中双去甲氧基姜黄素、去甲氧基姜黄素、姜黄素质量浓度分别为(1.720 0±0.016)、(19.403 0±0.087)、(29.465 5±0.077)mg/g。

2.2 酚红K-R溶液制备 为校正大鼠在体循环肠灌流实验中小肠对水分的吸收与分泌，选择肠不吸收性物质酚红校正药物因水吸收导致的浓度偏差。精密称定NaCl 7.80 g、KCl 0.35 g、CaCl20.37 g、NaHCO31.37 g、NaH2PO40.32 g、MgCl20.02 g、葡萄糖1.40 g，加水定容成1.0 L，即得空白标准K-R溶液。精密称取酚红20 mg，用空白标准K-R溶液溶解并稀释成酚红质量浓度为20 mg/L的溶液，即得酚红K-R溶液[12]。

2.3 大鼠肠灌流液制备 参考文献[13]方法，配制4组大鼠肠灌流液，用酚红标准K-R溶液，定容至100 mL即可。根据前期实验结果，每100 g蓬莪术饮片能够提取约1 mL的挥发油，然后制备浸膏大约为20 mL，故本实验挥发油和总姜黄素的比例基本与原饮片中含量比例保持一致。具体分组及各组组分见表1。

表1 4组大鼠肠灌流液组分及配比Tab.1 Composition and ratio of intestinal perfusion fluid for 4 groups of

2.4 酚红方法学考察 按“2.2”项下方法制备质量浓度为10.0 μg/mL的酚红对照品溶液，倍比稀释后，分别精密吸取0.5 mL，加入0.2 mol/L NaOH溶液5 mL，混匀。在558 nm处测定吸光度(A)值，精密度、稳定性和重复性试验均符合要求。以酚红对照品溶液的质量浓度为横坐标(X)，以吸光度为纵坐标(A)进行回归，得方程为A=0.169X-0.007 3(r=0.999 1)，在0.326 6～10.45 μg/mL范围内线性关系良好。

2.5 HPLC法建立

2.5.1 色谱条件 参照2020年版《中国药典》[1]，并根据实验实际情况得优化的色谱条件。Agilent Zorbax SB-C18色谱柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)；流动相4%醋酸-乙腈(52∶48)；体积流量1.0 mL/min；柱温25 ℃；检测波长430 nm；进样量10 μL；运行时间15 min。色谱图见图1，可知上述条件下各成分色谱峰分离度良好。

2.5.2 混合对照品溶液制备 分别取适量双去甲氧基姜黄素、去甲氧基姜黄素和姜黄素对照品，精密称定，并置于10 mL棕色量瓶中，用空白K-R溶液-甲醇(2∶1)溶液定容至刻度，摇匀即得。

1.双去甲氧基姜黄素 2.去甲氧基姜黄素 3.姜黄素1.bisdemethoxycurcumin 2.demethoxycurcumin 3.curcumin图1 各成分HPLC色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.5.3 样品处理方法 取2.0 mL大鼠原位肠灌注样品溶液，与1.0 mL甲醇涡旋混合2 min(2 000 r/min)后，在12 000 r/min条件下离心5 min，吸取上清液，过针式过滤器后置进样瓶中即得。

2.5.4 线性关系考察 分别精密吸取“2.5.2”项下的混合对照品适量，倍比稀释后，在“2.5.1”项条件下进样，以 对 照 品 质 量 浓 度为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)，进行回归，结果见表2，表明各成分在各自范围内线性关系良好。

表2 各成分线性关系Tab.2 Linear relationships of various constituents

2.5.5 精密度试验 取“2.5.2”项下混合对照品溶液，在“2.5.1”项条件下重复进样6次，测得双去甲氧基姜黄素、去甲氧基姜黄素和姜黄素含量RSD分别为1.30%、0.75%、0.66%，表明仪器精密度良好。

2.5.6 稳定性试验 取A、B、C、D 4组肠灌注液各6份，在“2.5.1”项条件下分别于0、2、4、8、12、24 h进样，记录峰面积，3种成分的变化率均在97.99%～100.13%之间，RSD均<2%(见表3)。表明经甲醇处理后的肠灌注液中各成分在24 h内稳定性良好。

表3 双去甲氧基姜黄素、去甲氧基和姜黄素的稳定性试验结果(%)Tab.3 Stability test results of bisdemethoxycurcumin,demethoxycurcumin and curcumin(%)

2.5.7 加样回收率试验 精密量取已知双去甲氧基姜黄素、去甲氧基姜黄素和姜黄素含量的肠灌注液6 份，分别加入适量对照品溶液，在“2.5.1”项条件下进样测定，以测定浓度与配制浓度之比计算回收率。结果表明，溶液中3种成分的平均回收率均在98.67%～99.82%之间(n=6)。

2.6 大鼠小肠壁对主要成分的物理吸附试验 取禁食12 h，自由饮水的SD大鼠，处死后取出小肠，用生理盐水洗净后置于D组肠灌注中孵育2 h，测定孵育前后双去甲氧基姜黄素、去甲氧基姜黄素及姜黄素的浓度，平行6次，计算孵育后3种成分的剩余百分率，考察其是否存在物理吸附情况。结果孵育2 h后灌流液中双去甲氧基姜黄素的平均剩余率为(99.03±0.37)%；去甲氧基姜黄素的平均剩余率为(98.67±0.62)%；姜黄素的平均剩余率为(99.00±0.37)%；表明孵育2 h 后大鼠小肠壁对3种待测成分无显著物理吸附[3]。

2.7 大鼠在体肠灌流试验方法 SD大鼠试验前12 h禁食不禁水，随机分为12组，每组3只，均麻醉后固定，沿腹中线打开，暴露腹腔。参照文献[12-13]方法，找到十二指肠段、空肠断及回肠段。在每个肠段两端各切一小口，先用37 ℃生理盐水缓缓注入肠段，洗去肠内容物。再用空白K-R溶液以2.0 mL/min 的体积流量循环10 min，排除肠内多余生理盐水。再取各组已预热至37 ℃肠灌流液以1.0 mL/min体积流量循环10 min后，将体积流量调节为0.2 mL/min，立即从装有灌流液的锥形瓶中取样2.5 mL，作为测定零时间药物浓度和酚红浓度的样品，然后向锥形瓶中补加2.5 mL含酚红的标准K-R溶液，其后每隔15 min按同样的方法取样并补足含酚红的标准K-R溶液，循环2 h后，中止试验。

2.8 肠灌注液中双去甲氧基姜黄素、去甲氧基姜黄素及姜黄素吸收差异性测定 在“2.5.1”项条件下对每个时间点取得的样品进行处理并检测，按文献[14]方法对所获得的数据进行处理，以小肠剩余药量的对数(lnX)对取样时间(t)作图，得直线，由直线斜率得吸收速率常数(Ka)，计算单位时间吸收率(P)，公式如下。lnX=lnX0-Ka×t；t1/2=0.693/Ka；P=(C0×V0-Ct×Vt)/(C0×V0×t)。以A组去甲氧基姜黄素在大鼠十二指肠吸收为例，可得其lnX-t曲线回归方程为Y=-0.070 8X+4.098 6(r=0.969 4)、Y=-0.065 4X+4.065 2(r=0.955 8)、Y=-0.047 4X+3.783 9(r=0.931 4)。

获得计算各组肠灌注液中3种待测成分的吸收速率常数Ka(h-1)、吸收半衰期t1/2(h)、每小时吸收百分率P(%)。采用IBM SPSS Statistics 21软件对所获得的数据进行t检验分析，结果见表4～6。

表4 不同组别中双去甲氧基姜黄素在大鼠小肠吸收差异性Tab.4 Differences in bisdemethoxycurcumin absorption in rat small intestine of different n=3)

表5 不同组别中去甲氧基姜黄素在大鼠小肠吸收差异性Tab.5 Differences in demethoxycurcumin absorption in rat small intestine of different n=3)

表6 不同组别中姜黄素在大鼠小肠吸收差异性研究结果Tab.6 Differences in curcumin absorption in rat small intestine of different n=3)

根据结果，就同一肠段而言，双去甲氧基姜黄素、去甲氧基姜黄素、姜黄素在3个肠段中均是醋品的吸收速率和吸收程度较佳，且配伍挥发油后抑制了3种成分在3个肠段中的吸收速率；而就相同成分，同一炮制及配伍方式，不同肠段而言的成分吸收差异，去甲氧基姜黄素、姜黄素总的趋势是在回肠段吸收速率较快，在空肠段的吸收程度较好。此外，本研究中仅两组分相互配伍后的C、D组检测到了双去甲氧基姜黄素，故A、B组中无双去甲氧基姜黄素吸收情况的数据。

3 讨论

中药醋制是临床常用的炮制方法，始载于西汉的《五十二病方》。醋制法能够引药入肝、缓和药性、增加药物有效成分溶出等[15]。甘彦雄等[4]发现蓬莪术醋制品能调控TGF-β信号通路以发挥抗肝炎作用，其中姜黄素和双去甲氧基姜黄素是主要有效成分。本研究发现，对比生品，醋制后蓬莪术总姜黄素3种成分在大鼠十二指肠、空肠、回肠的的吸收速度及程度都有所加快，这表明蓬莪术醋制后，不仅指标性成分含量增加，且更有利于其在体肠吸收。故推测蓬莪术醋制后抗肝炎的药效增强，可能与总姜黄素吸收增加有关。这与中药传统炮制“醋制入肝”的经典理念不谋而合，更印证了“蓬莪术入肝，通肝经聚血，破气中之血”的科学性[16]，也进一步提示总姜黄素可能是蓬莪术醋制“增效”的物质基础之一[17]。

本实验醋制后蓬莪术总姜黄素在小肠的主要吸收部位均发生了后移，生品总姜黄素成分中双去甲氧基姜黄素在十二指肠中吸收最好，醋制后增加了回肠中的吸收；醋制前去甲氧基姜黄素和姜黄素在空肠中吸收最好，醋制后在回肠中的吸收明显增加，配伍生品挥发油后在十二指肠中的吸收最好。醋品总姜黄素成分中去甲氧基姜黄素和姜黄素在配伍醋品挥发油前后均在回肠中吸收最好。故推测蓬莪术醋制后，其有效成分在体内的延后吸收，增加了有效成分与机体相互作用的时间，达到了醋制“增效”的目的[18]，但这仍需进一步的试验验证。

挥发油是蓬莪术中另一大重要组分，课题组前期研究已证明挥发油是蓬莪术发挥“破血消癥”功效的重要物质基础之一[19]。故本研究创新性地考察了蓬莪术生、醋品中的总姜黄素各与其挥发油配伍前后大鼠肠吸收差异，结果发现配伍挥发油后，总姜黄素中3种成分在大鼠小肠的吸收速度会降低。这可能是小肠自身吸收物质生理特性所致，两类物质同时经肠吸收产生竞争性抑制，从而影响总姜黄素的吸收速度。

研究中仅两组分相互配伍后的C、D组检测到了双去甲氧基姜黄素成分。相比去甲氧基姜黄素、姜黄素，该成分在蓬莪术中含量本就偏低，经大鼠肠吸收后，含量更是少之又少。而配伍挥发油后的肠灌注液中可检测到双去甲氧基姜黄素的变化情况，故推测总姜黄素配伍挥发油后可能会增加双去甲氧基姜黄素在肠灌注液的含量或稳定性。接下来，课题组也将采用更精密灵敏的仪器，对双去甲氧基姜黄素成分的大鼠肠吸收情况开展深入研究。此外，课题组前期试验发现双去甲氧基姜黄素在介导抗肝炎蛋白表达时，相对于总姜黄素的其他成分来说，效果更胜一筹[2]。因此蓬莪术组分配伍与其药效表达之间的复杂关系，值得我们更进一步的研究。