2种灭菌方式对止嗽立效丸HPLC指纹图谱和4种成分的影响

杨莹莹，张 璐，张文琴，刘瑛瑛，许信学，王晓燕*

[1.山西省药品审评中心(山西省医药与生命科学研究院)，山西 太原 030006；2.山西华康药业股份有限公司，山西 运城 044200]

止嗽立效丸由麻黄、苦杏仁、甘草、罂粟壳等7味中药组成，具有止嗽、定喘、祛痰作用，收载于《卫生部药品标准》中药成方制剂第七册，但其质量控制方法无含量测定及特征图谱项；相关文献也大多以盐酸麻黄碱、苦杏仁苷、吗啡等[1-5]为质控指标，未见指纹图谱及多成分含量测定的报道。中药制剂组成复杂，指纹图谱能较全面地反映出其成分的种类及数量，从整体上对其质量进行评价[6-7]。

中药常用灭菌方法有湿热灭菌和辐照灭菌[8]，其中后者较常用的是60Co射线，具有操作方便、常温常压、效率高、耗时短等特点[9-10]。但辐照可能会引起部分成分发生变化[11-12]，从而影响药物疗效，因此关于其安全性尚有争议[13-14]，《中药辐照灭菌技术指导原则》规定，采用辐照技术对中药进行灭菌时，必须说明它对产品质量的影响[15]。

本实验建立了止嗽立效丸HPLC指纹图谱和盐酸麻黄碱、苦杏仁苷、盐酸罂粟碱、甘草酸铵含量测定方法，比较60Co辐照灭菌、湿热灭菌对指纹图谱的影响及上述4种成分含量变化，以期客观全面地反映不同灭菌方式对该制剂所含成分的影响，为辐照灭菌工艺在其他中药制剂中的应用提供科学依据。

1 材料

Agilent 1200高效液相色谱仪，配置Agilent二极管阵列检测器，购自美国Agilent公司；AB104N型电子天平，购自梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；KQ3200DE型数控超声波清洗器，购自昆山市超声仪器有限公司；UPHW-I-90T型优普系列超纯水系统，购自成都超纯科技有限公司。

盐酸麻黄碱(批号171241-201508)、苦杏仁苷(批号110820-201607)、盐酸罂粟碱(批号1214-9602)对照品，购自中国食品药品检定研究院；甘草酸铵(批号MUST-13093010)对照品，购自成都曼思特生物科技有限公司。乙腈、甲醇为色谱纯；其他试剂均为分析纯；水为自制超纯水。

未灭菌、60Co辐照灭菌、湿热灭菌止嗽立效丸各5批，由山西华康药业股份有限公司提供，具体信息见表1。

表1 样品信息Tab.1 Information of samples

2 方法与结果

2.1 色谱条件 安捷伦ZORBAX SB-C18色谱柱(5 μm，4.6 mm×250 mm)；流动相乙腈-0.1%磷酸，梯度洗脱(0～30 min，8%～24%乙腈；30～40 min，24%～50%乙腈；40～60 min，50%～64%乙腈；60～70 min，64%～96%乙腈；70～77 min，96%乙腈；77～80 min，96%～8%乙腈)；体积流量1.0 mL/min；检测波长210 nm(0～24、42～77 min)、250 nm(24～42 min)；柱温30 ℃；进样量15 μL。

2.2 溶液制备

2.2.1 对照品溶液 精密称取盐酸麻黄碱、苦杏仁苷、盐酸罂粟碱、甘草酸铵对照品适量，甲醇溶解，制成分别含四者934、718、544、572 μg/mL的溶液，即得。

2.2.2 供试品溶液 精密称取丸剂粉末0.50 g，置于具塞锥形瓶中，加入80%甲醇(含0.5%磷酸)10 mL，盖塞，称定质量，超声提取30 min，冷却，80%甲醇(含0.5%磷酸)补足减失的质量，滤过，0.22 μm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。

2.3 HPLC指纹图谱建立

2.3.1 方法学考察

2.3.1.1 精密度试验 精密吸取同一份供试品溶液(批号Q201711131)15 μL，在“2.1”项色谱条件下进样测定5次，测得单峰面积大于总峰面积10%的共有峰相对保留时间RSD均小于1.0%，相对峰面积RSD均小于1.0%，相似度均大于0.99，表明仪器精密度良好。

2.3.1.2 重复性试验 取同一批丸剂(批号Q201711131)，按“2.2.2”项下方法平行制备5份供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样测定，测得单峰面积大于总峰面积10%的共有峰相对保留时间RSD均小于1.0%，相对峰面积RSD均小于3.0%，相似度均大于0.99，表明该方法重复性良好。

2.3.1.3 稳定性试验 取同一份供试品溶液(批号Q201711131)，于0、4、8、12、24、48 h在“2.1”项色谱条件下进样测定，测得单峰面积大于总峰面积10%的共有峰相对保留时间RSD均小于1.0%，相对峰面积RSD均小于3.0%，相似度均大于0.98，表明溶液在48 h内稳定性良好。

2.3.2 图谱生成 取15批丸剂，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，分别精密吸取15 μL，在“2.1”项色谱条件下进样测定，将检测结果导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)》软件，以S1为参照图谱进行数据匹配，采用平均数法生成对照指纹图谱(R)，结果共标定23个共有指纹峰(图1)，共有峰相对保留时间RSD均小于1.0%，色谱图见图2。由此可知，与灭菌前比较，湿热灭菌后峰21、22面积明显减小，峰5几乎消失，而60Co辐照灭菌后均无明显变化。

图1 对照指纹图谱Fig.1 Reference fingerprint

注：S1～S3分别为灭菌前丸剂、60Co辐照灭菌后丸剂、湿热灭菌后丸剂。图2 灭菌前后HPLC色谱图Fig.2 HPLC chromatograms before and after sterilization

2.3.3 相似度评价 将各批样品HPLC指纹图谱(图3)导入国家药典委员会《中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)》软件进行数据匹配，采用平均数法生成对照指纹图谱，建立共有模式，计算相似度，结果见表2。

图3 15批样品HPLC指纹图谱Fig.3 HPLC fingerprints of fifteen batches of samples

表2 15批样品相似度Tab.2 Similarities of fifteen batches of samples

由此可知，各批样品相似度均在0.91以上，其中灭菌前、60Co辐照灭菌后相似度较高，而且比较接近，表明60Co辐照灭菌对指纹图谱影响较小；湿热灭菌相似度较低，表明在该灭菌方式下指纹图谱变化较大。

2.3.4 共有峰峰面积比值比较 参考《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求(暂行)》[16]相关要求，经指纹图谱峰面积数据匹配后计算单峰面积占总峰面积比例。结果，单峰面积占总峰面积比例在5%～10%之间的共有峰为峰3、5、11、22，在10%～20%之间的为峰6、21。

选择稳定性好、分离效果理想的甘草酸铵(峰14)作为参照，计算灭菌前后共有指纹峰峰面积与参照物峰面积(A0)比值，以及灭菌前后共有峰峰面积比值的差值，公式为差值=[(Ax-A0)/A0]×100%，比较单峰面积占总峰面积比例≥5%共有峰的变化，结果见表3。

表3 灭菌前后共有峰峰面积比值比较Tab.3 Comparison of common peak area ratios before and after sterilization

由此可知，60Co辐照灭菌后，峰21、22面积明显减小；湿热灭菌后，除峰3、11外，其他共有峰峰面积比值的差值均大于±25%，尤其是峰5、21、22，表明湿热灭菌对峰面积较大的共有峰(≥5%)影响更大。

2.4 成分含量测定

2.4.1 指标成分选择 参考2020年版《中国药典》一部、相关文献和标准，预实验考察了盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱、苦杏仁苷、甘草苷、甘草酸铵、吗啡、盐酸罂粟碱等成分，与其指纹图谱特征峰进行保留时间和紫外扫描图谱的比对后，筛选出适合C18色谱柱分析和紫外检测，而且对照品易获得、色谱峰分离效果良好的4种成分作为指标，分别为盐酸麻黄碱(峰3)、苦杏仁苷(峰6)、盐酸罂粟碱(峰13)、甘草酸铵(峰14)，色谱图见图4。

3.盐酸麻黄碱 6.苦杏仁苷 13.盐酸罂粟碱 14.甘草酸铵3.ephedrine hydrochloride 6.amygdalin 13.papaverine hydrochloride 14.ammonium glycyrrhizinate图4 各成分HPLC色谱图Fig.4 HPLC chromatograms of various constituents

2.4.2 线性关系考察 取“2.2.1”项下对照品溶液适量，80%甲醇稀释成6个质量浓度，在“2.1”项色谱条件下进样测定。以对照品质量浓度为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)进行回归，结果见表4，可知各成分在各自范围内线性关系良好。

表4 各成分线性关系Tab.4 Linear relationships of various constituents

2.4.3 精密度试验 精密吸取同一份供试品溶液(批号Q201711131)15 μL，在“2.1”项色谱条件下进样测定5次，测得盐酸麻黄碱、苦杏仁苷、盐酸罂粟碱、甘草酸铵峰面积RSD分别为2.30%、0.78%、2.04%、0.58%，表明仪器精密度良好。

2.4.4 重复性试验 取同一批丸剂(批号Q201711131)，按“2.2.2”项下方法平行制备5份供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样测定，测得盐酸麻黄碱、苦杏仁苷、盐酸罂粟碱、甘草酸铵含量RSD分别为0.79%、2.26%、1.85%、0.90%，表明该方法重复性良好。

2.4.5 稳定性试验 精密吸取同一份供试品溶液(批号Q201711131)，于0、2、4、8、12、24、48 h在“2.1”项色谱条件下进样测定，测得盐酸麻黄碱、苦杏仁苷、盐酸罂粟碱、甘草酸铵峰面积RSD分别为2.43%、2.19%、2.66%、1.40%，表明溶液在48 h内稳定性良好。

2.4.6 加样回收率试验 称取各成分含量已知的丸剂(批号Q201711131)6份，每份约0.25 g，置于具塞锥形瓶中，精密加入对照品溶液1 mL，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样测定，计算回收率，结果见表5。

表5 各成分加样回收率试验结果(n=6)Tab.5 Results of recovery tests for various constituents (n=6)

2.4.7 样品含量测定 取15批丸剂，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样测定，外标法计算含量及其相对值[17]，平行3份，取平均值，再采用SPSS 22.0软件对其进行单因素方差分析，结果见表6。由此可知，与灭菌前比较，湿热灭菌后盐酸麻黄碱、苦杏仁苷含量降低(P<0.05)，而60Co辐照灭菌后各成分含量均无明显变化(P>0.05)。

表6 各成分含量测定结果(mg/g)Tab.6 Results of content determination of various constituents (mg/g)

2.5 化学计量学研究

2.5.1 主成分分析 将各批样品指纹图谱相对峰面积导入SPSS 22.0软件进行主成分分析，发现有2个贡献较大的主成分，累积方差贡献率为77.49%，即能代表原始数据77.49%的信息。以2个主成分的得分向量建立坐标，得到主成分得分图(图5)，可知湿热灭菌后样品均分布在FAC1坐标的负值区域，而灭菌前、60Co辐照灭菌后样品均分布在FAC1坐标的正值区域，表明前者与其他样品差异较大，而后两者之间差异较小。

图5 主成分得分散点图Fig.5 Score scatter plot of principal components

2.5.2 聚类分析 将各批样品相对峰面积导入SPSS 22.0软件进行系统聚类分析，采用组间均连法，以欧式平方距离为分类依据，结果见图6。由此可知，当阈值为25时，湿热灭菌后样品聚为一类，其他样品聚为一类；当阈值减小后，灭菌前、60Co辐照灭菌后样品又进一步分为2类，S4、S7、S10、S13聚为一类，S1与60Co辐照灭菌后样品聚为一类，表明湿热灭菌后样品所含成分与其他样品差异较大，而灭菌前、60Co辐照灭菌后样品所含成分较一致，与“2.5.1”项下结果吻合。

图6 聚类分析树状图Fig.6 Dendrogram of clustering analysis

3 讨论

3.1 色谱条件优化 本实验发现，以水(含0.1%磷酸)-乙腈为流动相梯度洗脱时分离效果良好，基线平稳。通过全波长扫描和多波长检测发现，在210 nm处色谱峰较多，基线平稳，信号强度高，故选择其作为主要检测波长；盐酸罂粟碱、甘草酸铵在250 nm处有最大吸收，故采用切换波长模式将这两者检测波长设为250 nm。

3.2 提取条件优化 本实验比较了水、甲醇、乙醇、乙酸乙酯的提取效率，结果显示水提取出极性成分较多，但弱极性者很少；乙醇提取20 min前色谱峰数量很少；乙酸乙酯只能提取出40 min以后的色谱峰；甲醇提取出的不同极性成分数量最多，响应信号高。

3.3 灭菌工艺比较 本实验建立了止嗽立效丸HPLC指纹图谱，指认了23个共有峰，同时对盐酸麻黄碱、苦杏仁苷、盐酸罂粟碱、甘草酸铵含量进行了测定。与湿热灭菌比较，辐照灭菌对各成分含量的影响较小，更有利于最大程度保留药材原有成分，能满足相关研究需求，为该技术在其他中药制剂中的应用提供科学依据。