circRNA在非酒精性脂肪性肝病诊治中的应用价值

杜晟楠，高静静，汪 涛，蒋元烨，曹 勤

上海中医药大学附属普陀医院 消化内科，上海 200062

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是一种排除酒精和其他已知明确的肝损伤因素所致的肝细胞内脂肪过度沉积为主要特征的临床综合征，其可能发展为非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、肝硬化甚至肝癌[1]。随着当今社会经济的高速发展，人们的饮食结构和生活方式发生了巨大的改变，NAFLD的发病率呈现全球化趋势,目前，以人群为基础的NAFLD患病率男性达30%～40%，女性达15%～20%[2]。在我国，NAFLD患病率达29.81%，已超过病毒性肝炎成为我国第一大肝病[3]。目前世界范围内并无针对NAFLD的特效药物，早期诊断及治疗已成为当今医学界面临的严峻挑战。近年来，国内外大量研究发现，环状RNA(circular RNA,circRNA)在NAFLD的发生发展进程中扮演了重要的角色，并且可能在NAFLD的诊断及治疗中具有重要的临床价值[4-5]。本文将对circRNA在NAFLD中的诊断及治疗最新进展进行综述。

1 NAFLD发病机制

NAFLD的发病机制非常复杂，目前仍未完全阐明，“二次打击”学说是该病发病机制最经典的学说，近年愈来愈多的研究成果不断超越及补充了经典的“二次打击”学说，出现了“多重打击学说”[6]。“二次打击”学说[7]认为，在NAFLD进展过程中，肝脏会经受脂肪变性和脂质氧化应激的双重打击。研究发现，胰岛素抵抗(insulin resistance,IR)在NAFLD形成过程中发挥极其重要的作用。IR会引起胰岛素过量分泌，从而促进外周脂肪组织分解和肝脏脂肪酸合成，造成脂肪在肝脏中的大量堆积，即形成肝脂肪变性，此为第一次打击。这使得线粒体中脂肪酸的氧化加快，以致产生大量的活性氧类物质。当产生的活性氧类物质数量超出清除能力，就会造成细胞内脂质的氧化应激，损伤肝细胞，形成第二次打击。“多重打击”学说是以“二次打击”学说为基础，提出脂毒性、线粒体功能障碍、内质网应激、炎性细胞因子和肠源性内毒素等多重打击因素协同诱发肝脏炎症的发生[8]，为NAFLD的发病机制提供了进一步更为准确的解释。

2 circRNA与NAFLD

circRNA是一种独特的单链RNA，由环状结构组成，参与了许多重要的生物学过程[9]。circRNA是一种重新被发现的具有共价闭合结构的、内源性非编码RNA，不具备3′或5′端，可以避免受到RNA外切酶的降解，结构更加稳定[10]。circRNA可以作为微小RNA(microRNA,miRNA)海绵来调节基因的表达，circRNA存在多个miRNA的互补结合位点,能够与线性mRNA共享miRNA应答元件,从而如同海绵般与线性mRNA竞争性结合miRNA,进而影响miRNA对线性mRNA的调控功能,产生类似于假基因转录物的调控作用[11]。已有研究[12]表明circRNA-miRNA-mRNA轴参与多种细胞事件，包括细胞凋亡、血管生成、转移等。近年来，关于非编码RNA与NAFLD的研究越来越多，大多数研究集中于miRNA和长链非编码RNA对于NAFLD发生发展的影响，circRNA被发现参与了NAFLD[12]、NASH[13]、肝纤维化[14]、肝硬化[15]、肝细胞癌[16]等多种肝脏疾病进程，尽管这方面的研究才刚刚开始，但已经有越来越多的证据表明circRNA与NAFLD关系密切，circRNA家族已成为NAFLD研究的重点领域之一。

2.1 circRNA参与NAFLD发生过程

各种原因引起脂质代谢紊乱导致肝脏脂肪沉积，是导致NAFLD发病的始动因素。肝脏脂肪沉积诱发包括氧化应激、前炎性因子的释放和内质网应激在内的一系列过程，进而引发肝脏的炎性反应，导致内皮一氧化氮功能紊乱，诱发IR，而IR和肝细胞脂肪变性又是NAFLD的主要原因[17]。circRNA可作为内源竞争RNA和miRNA海绵参与NAFLD的发生过程。

2.1.1 circRNA与IR IR是导致 NAFLD 发生及发展的重要原因之一。外周IR导致高胰岛素血症和脂质分解增多，产生和提供更多的游离脂肪酸到肝细胞，游离脂肪酸诱导脂质过氧化的同时，本身可以进一步阻碍胰岛素信号转导并加重IR[18]。到目前为止，已经发现一些与IR相关的circRNA。例如，circHIPK3已被证明可通过miR-192-5p轴上调FOXO1而导致高血糖和IR[19]。circRNA转铁蛋白受体也与IR相关，并且其过度表达可加重2型糖尿病和代谢性疾病的风险[20]。另一项研究[21]表明，位于线粒体中的脂肪性肝炎相关circRNA ATP5B调节因子的下调与IR及脂肪变性向NASH进展的过程密切相关。

2.1.2 circRNA与肝细胞脂肪变性 肝细胞脂肪变性是NAFLD发病的特征变化[22]，脂肪变性可能是由miRNA表达失调、甘油三酯的累积和脂质过氧化引起。近期研究发现，circRNA可以作为miRNA海绵参与肝脏脂肪变性。Guo等[23]发现，在高脂诱导的肝脏脂肪变性中，circRNA_0046367显著减少，其表达的下调阻止了miR-34a/PPARα的相互作用和脂质过氧化损伤，减轻了肝脏脂肪变性。另一研究[24]发现，在游离脂肪酸诱导的肝细胞脂肪变性过程中circRNA_0046366表达降低，相反，circRNA_0046366的上调能够破坏依赖miR-34a的PPARα信号的抑制作用，显著降低甘油三酯水平，缓解肝脏脂肪变性。另有报道[25]表明，circRNA_021412可通过circRNA_021412/miR-1972/脂蛋白1(LPIN1)信号级联影响肝脏脂肪变性。Li等[26]研究显示，circScd1在NAFLD肝脏组织中的表达明显降低，而其在组织内的过表达可显著抑制肝脏脂肪变性。上述研究均表明，circRNA与NAFLD肝脏脂肪变性进程密切相关。

2.1.3 circRNA与氧化应激 氧化应激在NAFLD的致病和发展中起着重要作用，是导致NAFLD致死性肝细胞损伤和疾病进展的关键因素之一[27-28]。研究[24]表明，circRNA_0046367干预可以有效地阻止以线粒体功能障碍、生长停滞和细胞凋亡为特征的脂肪变性相关脂质过氧化的肝毒性。circRNA的正常表达可能在减轻脂肪变性的基础上改善脂质氧化应激。Zhou等[29]发现，部分差异表达的circRNA，如mmu_circ_34116，可显著抑制肝星状细胞的活化，参与肝脏氧化应激损伤、巨噬细胞炎症等过程。因此，circRNA被认为是影响脂质过氧化损伤的潜在途径[12]。

2.2 circRNA作为NAFLD不同阶段的诊断生物标志物的研究进展

腹部超声虽是NAFLD的一线筛查方式，但当脂肪含量低于20%时，其灵敏度便大幅度下降[30]。肝活组织病理学检查仍是诊断NAFLD/NASH的金标准[31]。然而，肝活检作为一种有创检查，存在患者依从性低、抽样偏差、费用昂贵等局限性，因而寻找安全有效、敏感性高、经济实用的生物标志物帮助诊断NAFLD十分必要。近年来，circRNA已成为新的有价值的生物标志物，例如外周血circRNA可与蛋白质生物标志物联合共同作为心肌梗死的生物标志物[32]；在结直肠癌转移患者血清中circNSUN2不断上调，可作为结直肠癌肝转移的生物标志物[33]。而在NAFLD不同阶段，各种circRNA表达也存在差异，可以提示NAFLD不同的病理变化，表明其可能在NAFLD的诊断中具有重要价值。

2.2.1 circRNA与NASH 单纯性脂肪肝的特征是脂肪在肝细胞过度积累，为NAFLD发生的早期阶段，然而单纯性脂肪肝可逆且不易察觉，尚缺乏有力证据证明circRNA在此阶段具有诊断价值。越来越多的证据表明，NASH是NAFLD进展的“分水岭”，如果没有得到及时的诊断和适当的控制，NAFLD很可能会进展到NASH[34]，NASH与肝纤维化和终末期肝病高度相关[35]。Jin等[36]通过小鼠动物实验构建了circRNA-miRNA-mRNA网络。实验最终构建了4条circRNA-miRNA-mRNA通路，表明circRNA谱可作为NASH诊断的可靠候选指标。有学者[37]关于circRNA图谱的研究发现，在HepG2细胞中miR-1972与LPIN1之间存在某种关系，而circRNA_021412水平的降低可能会降低miR-1972的水平，抑制LPIN1表达，从而影响肝脏脂肪变性。故这种circRNA-miRNA-mRNA信号级联可能为诊断NAFLD提供新的思路。以上说明，circRNA可作为NASH诊断的良好候选基因。然而上述研究样本量有限，且结果均基于动物研究，是否可以推广到临床研究仍有待进一步探讨。

2.2.2 circRNA与NAFLD/NASH相关肝纤维化 据研究[38]报道，NAFLD/NASH相关肝纤维化过程中最基本的细胞生物学过程是肝星状细胞的激活。Chen等[39]采用基因芯片技术研究肝星状细胞中RNA的表达谱，发现circFBXW4在肝纤维化过程中表达下调，通过circFBXW4/miR-18b-3p/FBXW7轴增强circFBXW4的表达，抑制肝星状细胞的激活和增殖，减轻小鼠肝纤维化；而在另一项研究中，Chen等[40]发现circ_0074410通过α平滑肌肌动蛋白降低miR-9-5p的表达，促进肝星状细胞的激活，加重小鼠肝纤维化损伤。以上结果表明circFBXW4、circ_0074410表达水平影响了肝脏纤维化的进程，因此，其可能是判断肝纤维化的潜在生物标志物。但是，circRNA是否作为miRNA海绵参与了上述过程仍需要进一步的研究。

2.2.3 circRNA与肝癌 NAFLD和NAFLD/NASH相关性肝硬化均具有肝癌发生的高风险。肝癌是一种广泛存在的原发性肝脏恶性肿瘤，具有高度侵袭性，预后通常极差。现已证实，在肝癌的发生发展中过程中，不同的基因直接或间接调控肝脏细胞的周期、凋亡和存活。随着研究的深入，circRNA有望凭借其特异性成为新的肝癌诊断标志物。Li等[41]在RNA检测研究中首次筛选出超过1000种肝细胞癌来源的exonic-circRNA，揭示了circRNA在肝细胞癌检测与诊断方面的应用前景。Shang等[42]检测了肝癌变组织中circRNA，发现has-circ-0005075是其可能的潜在肝癌标志物。Zhu等[43]研究发现，肝癌组织中circ_0067934的表达增加，其潜在机制可能是circ_0067934作为miR-0067934海绵，抑制肝癌的侵袭和转移。这些证据均可说明，circRNA有可能作为一种新的肝癌标志物，并具有准确性、特异性和敏感性。不过，circRNA促进肝癌增殖、侵袭和转移的详细分子机制尚待阐明。此外上述研究均未能表明肝癌与NAFLD之间存在任何直接联系，未来还需更多前瞻性研究进一步证实。

2.3 circRNA可作为NAFLD治疗的潜在靶点 由于NAFLD发病机制复杂，单一的治疗方式往往难以取得良好的效果。干预和控制NAFLD的发生发展多从祛除病因、治疗原发病、改变生活方式以及药物治疗入手。然而，迄今尚缺乏确切的治疗NAFLD的有效药物，且目前的治疗药物主要在肝脏中解毒和代谢，过多地、盲目地或者不恰当地使用药物反而会增加肝脏的负担和肝毒性。寻找确切有效的NAFLD新的潜在治疗靶点很有必要。已有研究表明，circRNA可作为某些代谢性疾病的治疗靶点，Shan等[44]研究发现circHIPK3是减轻糖尿病相关视网膜病变的潜在治疗靶点。另有动物实验[45]证明mmu_circ_0000529基因敲除可作为降低血脂、治疗肥胖的潜在靶点。NAFLD与代谢性疾病关系密切，提示circRNA也可能在NAFLD治疗方面发挥重要作用。

胰岛素增敏剂二甲双胍是治疗NAFLD的有效药物[46]。Guo等[47]研究表明二甲双胍干预对高脂饮食诱导的NAFLD转录组改变有明显的缓解作用。在所有发生改变的转录因子中，circRNA存在差异表达，7个与之相互作用的miRNA与代谢或肝病有关，此研究表明circRNA或能作为NAFLD治疗的潜在依据，然而，在这项研究中并未观察到circRNA与NAFLD代谢之间存在任何直接联系。对于大多数NAFLD患者而言，NAFLD另一个重要的威胁就是肝再生能力受损。临床及实验研究都发现脂肪变性的肝脏在损伤或手术后再生功能受损、再生时间延长[48]，Li等[49]通过动物实验获取了肝切除术后肝再生初始阶段中差异表达的circRNA及其亲本基因，证实circ432、circ2077分别通过调控MAPK14、FN1在肝细胞增殖、能量代谢和物质代谢的关键网络中的表达水平来调节肝再生。但是，肝再生与NAFLD导致的肝细胞脂肪变性坏死有关，还与肝脏大部切除关系密切，此研究尚未确定circRNA对何种类型的肝再生产生影响。以上研究表明，circRNA在肝再生的机制中扮演重要角色，提示circRNA或可为治疗NAFLD提供新的靶点。

3 不足与展望

circRNA比其他线性非编码RNA在生物体内大量存在，高度保守且具有更高的稳定性，目前已成为分子生物研究的热点之一，它的多种生物功能预示着其具有成为各类疾病潜在治疗靶点的巨大潜力，对NAFLD的诊治及预防具有非常重要的意义，或可成为预测NAFLD疾病进程的新型潜在生物标志物[50]。尽管人们已经对circRNA在NAFLD诊治中的作用进行了一定的研究，但对于circRNA在NAFLD发病机制中扮演的角色仍缺乏深刻的认识，且目前 circRNA与NAFLD诊治的相关研究仍存在样本量不足、缺乏高质量临床试验等问题。随着高通量生物信息学方法的发展，circRNA在NAFLD诊断和治疗中的作用有望被进一步发掘，也需要开展大样本、多中心、前瞻性试验数据和研究成果来进一步证实circRNA在NAFLD疾病诊治中的价值。

利益冲突声明：所有作者均声明不存在利益冲突。

作者贡献声明：杜晟楠负责撰写论文、修改论文；蒋元烨、汪涛、高静静指导撰写文章；曹勤、蒋元烨负责拟定写作思路并最后定稿。