神经丝蛋白轻链和磷酸化的神经丝蛋白重链作为肌萎缩侧索硬化生物标志物的研究进展

王静雯，赵红东，时建铨，刘婷婷

肌萎缩侧索硬化(ALS)是一种进行性发展的致死性神经变性病，因其发病机制不明、异质性高、无特异性生物标志物，所以早期诊断困难，大部分患者从发病至诊断需要近1年的时间[1]。近年来学者们不断寻找诊断ALS的可靠生物标志物[2]，同时希望这些生物标志物能帮助我们客观地监测疾病进展程度、判断预后。近来，CSF和血液中神经丝蛋白轻链(NFL)和磷酸化的神经丝蛋白重链(p-NFH)在ALS中的诊断作用逐渐得到重视，成为研究的热点之一。神经丝蛋白(NFs)是成熟神经元轴突的主要细胞骨架蛋白之一，其在CSF和血液中的水平会随着神经轴突的损伤而升高，是一些神经系统疾病潜在的生物标志物[3-5]。NFs可能与ALS的发病机制有关[6-7]。ALS患者NFL和p-NFH水平不仅显著高于健康者及其他神经系统疾病患者，具有诊断价值，而且高水平NFL和p-NFH还预示着疾病进展快、生存期短[3-4,8-9]。本文就CSF和血液NFL和p-NFH作为ALS生物标志物在其诊断、监测疾病进展和判断预后的研究进展综述如下。

1 ALS概述

ALS多隐匿起病，发病率为0.01‰～0.02‰，缺乏有效治疗，患者一般发病2～5年后因呼吸衰竭而死亡[1]。ALS以上运动神经元(UMN)和下运动神经元(LMN)的联合变性为病理基础，因起病部位随机而存在不同的运动障碍表型，同时疾病扩展的方式及速度、UMN和LMN联合变性的不同组合及多系统受累使本病具有高度临床表型异质性，导致早期误诊、漏诊率高。近年来，学者们[10]在ALS影像学、电生理改变方面不断有新的发现；在生物学方面，目前ALS发病机制仍不明确，可能涉及轴突运输异常、细胞骨架异常、兴奋性氨基酸毒性、氧化应激、异常蛋白聚集、神经炎症、线粒体障碍、基因突变等[11-12]。随着这些发病机制的进一步明确，我们将对ALS有更全面的认识。众多报道提示，CSF和血液中NFL和p-NFH是轴突损伤的标志物，也是目前最有前景的ALS生物标记物。

2 NFs介绍

NFs是神经元特异性细胞骨架蛋白，属于Ⅳ型中间丝，主要存在于直径>5 μm的有髓轴突中，在稳定轴突形态及直径、维持轴突传导速度中起重要作用[5-6]。根据亚基的相对分子质量不同，NFs可分为NFL、神经丝蛋白中链(NFM)、神经丝蛋白重链(NFH)。这三种类型的NFs亚基均含有一个由310个氨基酸组成的中心α-螺旋杆状域、一个可变的球形氨基(N-)头端和羧基(C-)尾端[5,7]。

两个神经丝单体先二聚化形成α-螺旋卷曲螺旋，两个二聚体再以交错的反平行方式缔合形成四聚体，四聚体亚基并排结合形成单位长度的长丝，然后端对端退火形成成熟的直径约10 nm的神经丝聚合物[5]。这些聚合物合成后再进行O-糖基化、硝化、氧化、泛素化、磷酸化等修饰。这些修饰对NFs的结构及功能有着十分重要的作用，其中以磷酸化最为重要。磷酸化可以调节NFs之间的相互作用、影响轴突运输、提高NF抗蛋白酶水解的能力，对NFL mRNA的稳定性有一定的影响[13-14]。磷酸化的神经丝主要存在轴突内[8]，而NFM和NFH除了跟别的亚基一样在N端被磷酸化以外，它们在C端还有大量的磷酸化位点，从而能够被广泛的磷酸化[5]。

30多年前，第一代免疫分析法证实了CSF和血液中NFs的存在，随后又通过ELISA和增强化学发光法(ECL)准确测定CSF和血液中的NFs水平。随着第四代分析法SiMoA的出现，检测精确度进一步提高，甚至可以发现血液NFL的生理性变化[5]。这也是近年来血液NFs研究越来越多的原因之一。

NFs与ALS相关。长期以来，NFs聚集体一直被认为是散发性和家族性ALS运动神经元变性的特征性病理改变。目前NFs聚集的机制不明，过度磷酸化被认为是这种聚集体形成的主要原因之一[13]。有研究[13]认为，NFs聚集体引起神经退行性变的原因是它阻碍了轴突的运输。一项移除SOD1突变小鼠NFs尾部磷酸化区域结构的研究[4]发现，移除后小鼠ALS进展的减缓，提示ALS发病后NFs的升高可能是对轴突运输的一种保护，目的是为了能够恢复正常的轴突运输。此外，有学者[14]认为，ALS也与NFL聚集体能促进超氧化物歧化酶(SOD1)蛋白聚集有关。有研究[13]发现，Charcot-Marie-Tooth病2E亚型(CMT2E)患者的NF基因突变会导致NF代谢障碍而致病。这让学者们意识到NF聚集体本身对运动神经元变性的作用有限，更可能是由上游事件如NF亚单位的表达改变引起的NF结构组装异常导致的。其中，NFL mRNA的稳定性改变与运动神经元变性最为相关，但目前机制尚未明确[14-15]。

3 NFL和p-NFH的诊断价值

众多研究[1,4,7,9,16-24]证实，ALS患者NFL和p-NFH水平显著升高。这种升高在疾病早期就已经出现[4,24]，可以用于ALS与健康人、类ALS及其他神经系统疾病的鉴别，且NFL和p-NFH水平与诊断延迟时间呈负相关[3,6,17]。NFL和p-NFH作为ALS的早期诊断生物标志物具有较高的敏感性和特异性[4,9,16,22]。因中枢神经浸于CSF中，故CSF NFs水平较血液更高，诊断性能也更佳[1,8-9,17-18,24]。在区分ALS患者和健康人群时，CSF NFL的敏感性高达97%，特异性高达95%[9]。有研究[1]以CSF p-NFH 750 pg/ml为分界线区分ALS与临床表现难以与ALS鉴别的其他神经系统疾病[神经根/丛病、多灶性运动神经病(MMN)、Kennedy病等]发现，其敏感性为92.9%，特异性为96%。对于那些刚出现症状但尚不符合ALS诊断标准的患者，可以在临床检查和EMG检查的基础上联合NFs水平检测，帮助ALS早期诊断。

NFL和p-NFH还可以作为ALS的预测指标。一项研究[24]指出，早在ALS患者出现临床表现前11.6个月时，其NFL水平就已经开始升高。NFL是轴突中最多的亚基，当CNS轴突损伤后，很快就能检测到血和CSF NFL水平的升高[6,19,22]。上述研究[24]提示，ALS神经退行性病变可能早于临床症状出现，检测NFL水平有助于早期发现、量化这种疾病的亚临床状态，预测症状出现时间。Weydt等[25]发现，NFL和p-NFH水平在ALS患者出现症状后迅速上升了10倍。在未来，或许可以利用NFs的水平变化监测高危人群(如携带C9orf72等突变基因的无症状患者)。若NFs水平突然出现上升，要考虑基因表型的转化及临床症状的出现，尽早开展治疗。

一些研究发现，血液与CSF NFs水平之间[1,8-9,16,20,24,26]、血浆/CSF p-NFH和NFL水平之间[3,17,19,22,26]具有正相关性，因而可以用采集血液样本的方法而代替腰椎穿刺，既降低了成本又安全便捷。

进一步研究NFL和p-NFH在ALS诊断中的优缺点时发现：(1)因NFL易被蛋白酶降解，所以CSF p-NFH较CSF NFL诊断的敏感性更胜一筹[3,17,19]；(2)血液中p-NFH聚集可以引起“钩状效应”[1,9,27]，导致免疫法测定时抗体结合位点减少，影响测量结果，降低了血液p-NFH指标的敏感性，因而血液NFL诊断性能更优[26,28]。NFs水平可能与基因型有关。研究[29-30]表明，SOD1突变相关的ALS患者CSF NFL水平低于野生型ALS患者。Gendron等[31]的研究结果显示，C9orf72突变患者的CSF p-NFH水平更高，与Huang等[26]研究结果一致。但值得注意的是，Huang的队列中除了1例有C9orf72突变的患者病情进展速度较慢外，其余有C9orf72突变的患者疾病进展均较快，所以高水平NFs反映的是疾病进展速度还是基因突变本身带来的影响尚不确定。但也有C9orf72或SOD1突变与血清NFL水平的相关性研究[4]得到了阴性结果。所以NFs与基因表型的关系还需进一步探讨。

ALS诊断时要满足“UMN、LMN同时受累”和“病情呈进行性发展”这两大特点。通过临床判断UMN是否损害并不可靠，当LMN受累程度严重时，可完全掩盖UMN受累的体征。此外，一些对锥体束有影响的疾病，如颈椎病等，难以与ALS区分，所以临床迫切需要一种更加客观、敏感的UMN受累的判定指标。一些研究[7,16,28,32-33]发现，NFL和p-NFH在判断UMN受累中有一定的作用：以UMN损害为主的ALS，CSF p-NFH明显高于UMN、LMN损害的典型ALS；临床合并UMN受损表现的ALS，比单纯以LMN受损为表现的患者NFs高；NFL水平也与UMN受累程度呈正相关。

NFs是轴突损伤的非特异性生物标志物。NFL水平会随着衰老有一定程度的生理性升高[4-5]。中枢神经轴突受损的疾病患者，如卒中、创伤性脑损伤、多发性硬化症、多系统萎缩、创伤性脑损伤等，其NFs也会升高[4-5,20,23,28]。原发性侧索硬化、遗传性痉挛性截瘫等UMN病也会有NFs水平的升高[18,21,28]。但ALS是一种快速进展的神经系统退行性病变，其NFs水平显著高于那些慢性起病、逐渐加重的疾病，如原发性侧索硬化、遗传性痉挛性截瘫等。有研究[3]将ALS与急(亚急)性神经元或以轴突损伤为主的疾病进行比较发现，NFs作为诊断生物标志物的可靠性是有限的。NFs需要与其他诊断手段相结合，来提高其诊断及预测的准确性和可靠性。同时，还可以通过联合神经炎症、异常蛋白聚集等不同病理生理机制来源的生物标志物，提高诊断的敏感度和精确度[16,34-35]。目前，已有相关研究[29]发现了ALS患者NFs水平与皮质脊髓束的DTI测量参数值——部分各向异性(FA)越低、径向扩散率(RD)的相关性，并提出了NFs与影像学联合诊断的可能性。

4 NFL和p-NFH用于监测疾病进展

临床上通常用ALS功能评分量表(ALSFRS-R)评价疾病进展的速度，ALSFRS-R评分下降越快，提示病情进展越快。有研究[1,3-4,6,8-9,17,22,26,28,32]发现，NFs水平越高，病程越短，疾病进展越快。但NFs在整个病程中的变化是很复杂的，其与病程的关系受到诸多因素的影响，所以还需结合NFs的动态变化评价病情进展的情况[23,27]。在ALS病程中，NFL和p-NFH水平在早期一定时间内进行性升高[17,21-24]。这种早期升高的原因还无定论，一方面可能与ALS疾病早期病情进展较快，快速的轴突病变导致NFs水平升高有关；另一方面可能是随着病情发展，受累的轴突数量增多导致的[23]。还有学者[23,27]提出，疾病进展快、生存期较短的患者，其早期p-NFH水平就达到峰值，随着存活的神经元越来越少，疾病后期p-NFH反而会降低；反之，进展慢、生存期较长的患者中p-NFH水平会随着变性程度的加重而慢慢升高。

同一种生物标志物在同一患者的不同阶段中保持相对稳定才能满足临床可重复测量的要求。多数研究认为，CSF p-NFH水平[8,17,26]、CSF和血液中NFL[4,6,9,24,26]水平能够保持相对稳定。一些血液样本的数据[27]提示，血液p-NFH水平稳定性稍差。一项长达15个月的随访研究[9]发现，NFL水平在快、中、慢ALS进展组中的变化是不同的，各组血浆NFL水平均无显著增高，快进展组血清NFL水平显著增高，快进展组、慢进展组CSF NFL水平显著增高。另外，各组增加的速度也不一致。Posen等[17]也发现，不同进展组的NFs水平变化不一致。Boylan等[8]在为期12个月的随访中发现，随访4个月后血液p-NFH水平与ALSFRS-R的下降快慢程度无明显相关性，提示血液NFs指标与临床的相关性不如CSF NFs。这些研究结果还不能完全被解释，但与以下因素密不可分：(1)NFs的水平受到自身聚集、降解、自身抗体免疫反应等影响；(2)血液和CSF中NFs水平的代谢机制不完全一样；(3)ALS的病理生理机制、运动细胞丢失动力学机制尚未明确[27]；(4)统计学方法以及检验手段具有差异。

5 NFL和p-NFH用于判断预后

研究[1,3-4,7-9,16,22-23,26,28]指出，ALS患者NFs水平与生存时间呈负相关，NFL和p-NFH越高，生存时间就越短，预后越差。CSF和血液NFL、CSF p-NFH是ALS独立的生存预测因子[9,18,28,36]，可用于判断ALS的预后[16,22]。但有研究[27]提示，血浆p-NFH对预后的预测价值有限。ALS患者预后受起病年龄、起病部位、呼吸肌受累情况等因素的影响[12,36]。多数研究[3-4,6-7,17,19,23,32]未发现NFL、p-NFH水平与起病部位相关，但有研究[8,20]发现球部起病的ALS患者比肢体起病患者的p-NFH水平更高。2014年Tortile等[37]首次提出了“泛化时间(TTG)”的概念，指症状从起病部位到累及全身的时间。TTG越短提示疾病的侵袭性越高，预后越差；初始CSF NFL水平越高，TTG越短。Li等[20]也在中国人群中发现了CSF和血浆p-NFH与预后的类似关系。Gendron等[31]认为，CSF中的p-NFH不仅是散发型ALS较好的预后预测指标，也是携带C9orf72基因突变的ALS患者较好的预后预测指标。ALS患者NFs水平不受年龄、性别以及利鲁唑治疗的影响[3-4,6,9,23-24]，提示NFs与临床因素更为相关，肯定了NFs作为ALS生物标志物的价值。

6 展望

综上所述，ALS患者NFL和p-NFH水平显著升高，在诊断、监测疾病进展及判断预后中有一定的应用价值。但NFs进入临床使用前还有许多问题需要解决，如制定标准化检测方法，使数据具有可比性，以及统一NFs的参考值等。需注意的是，有诸多研究发现Alzheimer’s病的tau蛋白病以及其他神经变性病也有这些生物标志物变化，对此标志物的特异性、相关疾病的cutoff值等还需进一步探讨确定。尽管如此，NFL和p-NFH仍然是目前ALS最有前景的生物诊断标志物之一，相信随着影像学技术的发展，结合电生理、基因检测等方法，将有助于进一步研究ALS的发生、发展机制。