白桦三萜提取、检测和积累影响因素研究进展

姜树忠

(辽宁省森林经营研究所，辽宁 丹东 118002)

白桦Betulaplatyphylla又称为臭桦、桦木，为桦木科Betulaceae桦木属Betula植物[1]。白桦分布广泛，北至俄罗斯远东及东西伯利亚地区，南至我国云南，东至日本和朝鲜，西至新疆和西藏太昭，在我国白桦主要分布在东北大小兴安岭、长白山、完达山等地区[2-6]。白桦是重要的落叶乔木树种，适应性强，抗寒、喜光、喜酸性土壤、耐贫瘠，天然更新快，生长快，常为采伐迹地和火烧迹地的先锋树种[7-11]。白桦具有重要的生态价值、经济价值和药用价值。白桦木材光滑洁白，纹理细致，常为家具、矿柱、枕木、工艺品、造纸业、餐饮业等提供原料，大径级白桦还是重要的航空胶合板原料，树皮可做栲胶，汁液可做饮料[12-17]。白桦树皮组成成分复杂，药理活性多样，树皮中含有白桦脂酸、齐墩果酸和白桦脂醇等三萜类化合物[18]，此类物质具有重要的药用价值，据《本草纲目》中记载，白桦树皮可用于治疗疥疮、黄疸、乳痈等疾病[19-21]。从20世纪初，现代医学证明，三萜物质在消炎、抗肿瘤、抗病毒、抗菌、降血脂、清热利湿等方面效果显著[22-24]。经过大量研究，科研人员发现三萜化合物中的白桦脂酸作为生物抑制剂在对抗癌细胞和HIV病毒时还具有高效低毒的特点[25-26]，因此三萜类化合物在医药研究中有巨大潜力，值得深入研究。

三萜类化合物目前通过生物提取和人工合成的方式获得，现在主要以生物提取为主。目前研究中，三萜化合物的提取、分离和检测方式众多，效率也不同。三萜化合物因为结构复杂，极性相似，不易分离提纯，而应用中需求量大，要求纯度较高。三萜化合物虽然广泛存在于自然界大多数植物中，但含量极低。目前研究发现，植物中白桦的三萜化合物含量相对较高，有利于提取。人工化学合成方式理论上可行，但是三萜类化合物结构太过复杂，目前还未完全弄清三萜化合物合成具体方式，化学合成效率低，成本高[27]，无法应用于工业生产。由此可见改进提取方式、提升原料含量和人工合成都急需进一步研究，达到提高三萜化合物生产效率的目的，从而提高三萜化合物在医药研究和其他相关的科学研究中的原料应用保障。

1 白桦三萜概况

白桦三萜(Triterpenes ofBetulaplatyphylla,TBP)主要包括白桦脂醇(Betulin,C30H50O2)、白桦脂酸(Betulinic acid，C30H48O3)[28]和齐墩果酸(Oleanolic acid，C30H48O3)等化合物。白桦脂醇和白桦脂酸都属于羽扇豆烷型的五环三萜类化合物，齐墩果酸属于齐墩果烷型的五环三萜类化合物，都是十分重要的天然次生代谢产物，广泛分布于各种植物中，且白桦中的三萜化合物含量普遍高于其他植物，因此白桦是白桦三萜的主要提取原料。

白桦脂醇别名桦木醇和桦木脑，于1788年被Lowit在白桦中发现和分离出来，1952年才被最终确定化学结构。白桦脂醇溶于乙醇、苯、乙醚和氯仿等溶剂，微溶于水。白桦脂醇在白桦树皮中含量最高，为树皮干重的10%～34%[29]，白桦的种源类型、树龄和生长环境都对白桦脂醇含量产生显著影响。

白桦脂酸又叫白桦酸和桦木酸，在白桦、铁刀木、酸枣、大叶胡枝子和杜仲等植物中都有发现。桦木酸为无色透明结晶，能溶于甲醇、乙醇和丙酮等有机溶剂，熔点为316 ℃[30]。白桦酸在白桦树皮中的含量约为树皮干重的0.025%，虽然天然含量低，但可由白桦脂醇经氧化、还原两步反应得到。1994年Fujioka等发现白桦脂酸可以抑制HIV病毒复制和有选择性地抑制黑色素瘤细胞生长，之后越来越受到国内外广大科研人员的关注。大量研究证明其药理活性多样，高效低毒，作用机制不同于常规药物，在治疗癌症、降脂、抗病毒、抗艾滋病等方面有望研究出新型药物，具有广阔的应用前景[31-32]。

2 白桦三萜的提取、纯化和检测

2.1 白桦三萜的提取与纯化

目前主要提取方式为索氏提取法[33]、超声波醇提法、氯仿浸提法、回流法、超临界萃取[34]和亚临界提取法等。胡祥正等[35-36]使用索氏提取法，确定乙醇作为提取剂的最佳固液比(g∶mL)为0.083，抽提时间6 h，再用异丙醇和乙醇作为溶剂，通过两步重结晶纯化桦木醇，最终产率为19.8%，纯度98%。范桂枝等[37]以白桦为材料对回流法、索氏提取法、超声波醇提法和氯仿浸提法提取白桦脂醇进行对比，结果发现索氏提取法和超声波醇提法提取效率较高。李影等[38]通过比较不同的提取方法和不同的纯化方法，获得了白桦脂醇提取和纯化的最佳方法，使用回流法和重结晶法，使重结晶产率达到38%，纯度达到99.81%。马博玉等[39]以白桦树皮为原料，使用液泛提取设备，确定了连续提取白桦脂醇的最佳参数，提取率为90.39%，纯度为89.12%。张静等[40]使用亚临界提取法对白桦脂醇提取也得到了较高的提取率。詹亚光等[41]在优化白桦愈伤组织提取三萜化合物条件的研究中使用分光光度计法测定总三萜含量发现，此方法测总三萜稳定、方便且重现性好，提取温度不同会导致提取结果发生变化，提取最佳温度为40 ℃。综上所述，三萜化合物的提取和纯化方法多种多样，目前超声波醇提法效果较好，使用广泛；重结晶法的纯化效果显著，但没有能应用于工业化大量生产白桦三萜的方式，因此应找到一种适用于工业化生产且效率高的提取和纯化方式。

2.2 白桦三萜的检测

三萜化合物经过提取后的检测工作是评价提取纯化方式和评价样品中三萜化合物含量的重要工作，因此测定方法的准确性和可操作性都极为重要。目前检测三萜化合物的主要方式为高效液相色谱法、气相色谱法、高效毛细管电泳法和比色法。张泽等[42]使用高效液相色谱法测定白桦脂醇的含量，以C18色谱柱，流动相为甲醇∶水(88∶12)，紫外检测波长210 nm，柱温30 ℃，流速1 mL·min-1，柱压6.4 MPa的条件进行检测，结果显示线性范围为15.0～300.0 μg，平均回收率为93.93%，与气相色谱法和比色法相比，此方法更准确和简便。赵国玲[43]建立了一种能同时检测白桦脂醇和白桦脂酸含量的方法，在C18反应柱，流动相为乙腈∶水(86∶14)，流速1.0 mL·min-1，进样20 mL的条件测定，此方法结果准确度高，R2均在0.99以上，能在20 min内完成两种物质的检测。于有强等[44]利用高效液相色谱法建立了能同时检测白桦脂酸、齐墩果酸和熊果酸的方法，以C18色谱柱，流动相甲醇∶水(91∶1)，流速0.6 mL·min-1，210 nm紫外检测波长，20 μL进样量，结果显示R2在0.999 8以上，精密度、稳定性和重复性都较好。谭朝阳等[45]使用高效液相色谱法测定齐墩果酸，结果有良好的线性关系，平均回收率为99.69%。孙宏等[46]使用分光光度法对白桦树皮的三萜化合物总量进行分析，结果显示精密度RSD为2.16%，回收率为96.16%～98.85%。方玉栋、祁逸梅等[47-48]使用气相色谱法对三萜化合物进行测定，此方法对样品衍生化后才能测定，测量难度大。刘海兴等[49]使用毛细管电泳法有效地测定了石楠叶中齐墩果酸和熊果酸含量，平均回收率分别达到102%和104%。从大量研究可以看出，现在普遍用高效液相色谱法检测三萜化合物，此方法方便且准确度高，易重复，能有效测定三萜化合物含量，缺点是液相色谱法检测成本高，样品数量多时费时费力且价格较高。

3 白桦树中三萜积累的研究

白桦产生三萜化合物是植物为了适应环境而长期进化的结果，因此积累的量不仅与遗传因素有关，还与环境因素有关。范桂枝等[37]以不同种源的白桦为研究材料，测定不同种源白桦不同部位的白桦脂醇含量发现，同龄树的树高、胸径对白桦醇的影响不显著，不同种源间的含量差异显著，白桦脂醇的含量不仅受到种源和遗传因素的影响，同时也受到地理环境和气候的影响，在白桦中分布含量为外皮>枝皮>内皮>芽>叶>根>花粉。王倩[50]在研究白桦树皮中三萜化合物分布时发现不同的三萜化合物在不同高度含量差异不显著，树皮最外侧含量最高，内侧略有降低，差异不显著，树皮内的三萜物质含量随季节的变化不显著。李新宇等[51]以白桦幼树为材料，研究不同光质和光强对三萜积累的影响，发现红、黄、蓝、绿4种光均降低了茎外皮的白桦脂醇和齐墩果酸含量；蓝光处理显著提高叶片白桦脂醇含量，绿光提高叶片齐墩果酸含量，白桦脂醇和齐墩果酸含量变化显著受到了季节的调控。李春晓等[52]以白桦幼树为材料，研究茉莉酸甲酯(MeJA)、水分和氮肥处理对白桦三萜物质积累的影响和白桦三萜的积累规律，发现幼树总三萜在根皮最少，叶片和茎皮中最多，根皮和茎皮的总三萜积累高峰为7月份和8月份，叶片为6月份；干旱胁迫在6月和7月分别有利于叶和茎积累三萜物质，干旱不利于根中三萜积累；6-7月施氮肥有利于茎中三萜积累，7-10月施氮肥或MeJA都有利于叶和根积累三萜物质。

4 不同物质对白桦三萜积累的影响

白桦三萜是植物的次生代谢物，含量较低。次生代谢物通常需要特殊的物质或环境刺激才能加快合成，不同植物中不同的次生代谢物往往需要不同的物质刺激产生，通过白桦组织培养和白桦细胞悬浮培养可以研究不同物质对白桦三萜积累的影响。

4.1 培养基种类和生长调节剂的影响

王博等[53]以白桦优树腋芽为外植体诱导产生愈伤组织，发现培养基中NO3-含量略高于NH4+含量及培养基含丰富的有机物有利于白桦三萜积累，低浓度的6-BA和TDZ有利于三萜积累，过高或过低浓度的6-BA和NAA组合都不利于白桦三萜积累，白桦三萜的积累和细胞分裂生长不是同步进行。尹静等[54]研究组培苗愈伤组织中三萜化合物分布和含量时发现，白桦细胞悬浮培养可以得到白桦脂醇和齐墩果酸，培养过程中营养物质与细胞的全面接触和细胞间物质的传递，有利于三萜化合物积累。范桂枝等[55]以白桦悬浮系为材料，通过试验发现B5培养基和20～30 g·L-1FW的接种量有利于白桦悬浮细胞的生长和三萜积累，在培养过程中，细胞生物量和三萜的积累量成正相关，三萜的产量随生物量的增加表现为增长趋势，培养液中的成分降低也会限制细胞增殖和三萜的合成。

4.2 光照的影响

范桂枝等[56]以白桦组培苗茎段为材料，研究了不同光质和光周期对白桦三萜积累的影响，发现不同的光质和光周期都对三萜化合物积累有调节作用。王博[57]以白桦组培苗为材料，通过诱导白桦产生愈伤组织，对愈伤组织进行液体悬浮培养和固体组织培养，研究白桦三萜在愈伤组织中的代谢调控发现，以蓝色光质，强光照，蔗糖浓度为30 mg·L-1，0.8 mg·L-16-BA+0.6 mg·L-1NAA，IS为基本培养基是最适合白桦三萜产生的固体培养基，蓝光对白桦愈伤组织积累白桦三萜有利；悬浮细胞培养生产白桦三萜的效果比固体培养基更好，最佳的悬浮培养条件为B5培养基，添加0.4 mg·L-16-BA和0.2 mg·L-1TDZ，接种量10 g·L-1(FW)。

4.3 外物刺激的影响

姜洋等[58]研究一氧化碳(CO)对白桦悬浮细胞产生三萜化合物的影响时发现，CO对白桦悬浮细胞产生三萜物质有促进作用。黄雅婷等[59]研究硝普钠(SNP)对白桦悬浮细胞积累白桦脂醇的影响时发现，SNP分别和K+或Ca2+互作可以更好地促进白桦悬浮细胞积累白桦醇。孙美玲等[60]以白桦悬浮细胞为材料，研究过氧化氢(H2O2)介导真菌诱导子促进白桦脂醇积累时发现，外源H2O2降低细胞活力和干物质积累，提高了白桦酯醇的含量。王艳等[61]在研究钙离子介导水杨酸(SA)诱导白桦悬浮细胞三萜合成的作用时发现，水杨酸能诱导白桦悬浮细胞产生三萜化合物，在钙离子的作用下，水杨酸的诱导效果被加强。常志凯等[62]研究高温胁迫对白桦悬浮细胞积累三萜化合物的影响，确定了利用高温胁迫促进白桦悬浮细胞的最佳温度为50 ℃，胁迫2 h后24 h取样。翟俏丽等[63]使用真菌诱导子促进了白桦悬浮细胞中三萜的积累。

5 小结与展望

5.1 小 结

目前，白桦三萜经过多年的研究取得了一定的进展。①白桦三萜的提取、纯化和检测方面，众多学者研究了多种方法，以超声波醇提法为主要的三萜提取方法，此方法相对简便且效率高；白桦三萜的纯化主要用重结晶法，此方法得到的纯化产物纯度较高；白桦三萜的含量检测主要为高效液相色谱法，此方法能有效分离检测不同三萜化合物的含量，检测精确度高，可重复性强。②白桦三萜在白桦中分布积累的特点，树中大部分都有分布，树干外皮三萜含量最高，花粉中最少；白桦三萜的含量不受树高和茎粗的影响；种源、树龄和季节会影响三萜含量，但具体原因还不清楚，可能与季节变化的温度、光照、降雨量等发生变化有关；通过水分、氮肥、茉莉酸甲酯等物质可调控白桦三萜的积累。③通过组织培养，发现白桦愈伤组织可以产生三萜化合物，且改变培养基的种类和培养条件都可调控三萜化合物的积累。④通过固体培养和细胞悬浮培养研究发现，光质、光强、温度等环境因子和水杨酸、H2O2、CO、真菌诱导子、SNP、K+、Ca2+等多种物质都对白桦三萜的积累有影响，通过适当的培养条件可有效提升白桦三萜的产量。

5.2 展 望

通过大量的研究，白桦可以通过适当的方式提升三萜产量，但是提升的量不足以改变产量低的现状。白桦生长周期长，通过树皮获取三萜物质会破坏大量白桦资源。利用细胞悬浮技术培养白桦细胞，研究三萜物质的产生和积累效率更高、周期短，能节省大量人力物力。目前可以继续以细胞悬浮培养的方式研究白桦三萜在细胞中合成和积累的机理，找到能引导细胞大量合成白桦三萜的方式，结合基因工程技术，最终获得专产三萜物质的细胞，使三萜物质能工业化大量生产，为三萜化合物的应用研究提供保障，最终为人类的疾病治疗提供服务。