基于网络药理学和分子对接技术探讨西红花治疗阿尔茨海默病的潜在作用机制

池宪宏，陈大章，喻清莉，陈亮杏，向世俊，陈倩文，郭晋言，周玉其，杨 春*，杜以宽 （.广东

医科大学干细胞与再生组织工程重点实验室，广东东莞 523808；2.东莞市人民医院中心实验室，广东东莞 523059）

阿尔茨海默病(Alzheimer's disease,AD)是发生在老年及老年前期，以进行性认知功能障碍和行为损害为特征的中枢神经退行性病变[1]，其病理主要表现为神经细胞外β 淀粉样蛋白(Aβ)沉积和神经细胞内神经元纤维缠结[2]。临床上对AD 实施治疗的方式较多，以药物治疗为主，但是目前这些药物的治疗具有一定的不良反应[3]，而中药在AD 的预防、治疗及康复等方面具有重要作用，并日益受到了医务工作者的青睐[4]。

AD 的发病机制复杂多样，中医认为主要与气血阴阳亏虚、血瘀等相关。宜通过益气补肾、填髓益智、活血化痰、解毒通络等方式治疗[5]。有研究表明，临床上部分具有活血化瘀等功效的中药，例如参芪醒脑颗粒，其治疗AD 的效果优于西药[6]。西红花(Crocus sativusL.)又称藏红花。《中国药典》指出：西红花具有活血化瘀、凉血解毒、解郁安神等功效。近年来，随着对西红花成分和药理活性研究的深入，人们发现其具有丰富的活性成分，在治疗精神类疾病、神经退行性疾病、代谢性疾病、心血管疾病以及学习记忆障碍等方面显示出了潜在的药用价值[7]。已有研究表明，西红花对减少Aβ 沉积、抑制tau 蛋白过度磷酸化、抗氧化、记忆力改善等多方面有一定的效果[8-13]，但其中可能的作用机制却鲜有文献的报道，因此仍需进一步探索。

网络药理学是在“疾病-基因-靶点-药物”相互作用网络的基础上，通过网络分析，系统综合地观察药物对疾病网络的干预和影响[14]。这项技术不仅符合中医中药的治疗理论，也能为药物作用机制的探索指明有价值的研究方向，从而进一步推动西红花在AD治疗方面的开发和利用。分子对接技术是一种从已知结构的受体(靶蛋白或活性位点)和配体出发,通过化学计量学方法模拟分子的几何结构和分子间作用力来进行分子间相互作用识别并预测受体-配体复合物结构的方法，其通过模拟药物-受体相互作用，阐明药物的作用机理，增加药物准确性、灵敏性、特殊性、预测性[15]。而这一技术有利于挖掘西红花针对AD的临床应用价值。因此，本文通过网络药理学和分子对接技术揭示西红花治疗AD的潜在作用机制。

1 材料和方法

1.1 西红花有效成分和靶点的收集

通过中药系统药理学数据库与分析平台(TC‐MSP,https://tcmspw.com/tcmsp.php)收集西红花的有效成分，并以其成分的生物利用度(OB)≥30%和药物相似性(DL)≥0.18 为筛选条件，然后参考查阅的文献[16-17]补充两个与西红花治疗AD 相关的有效成分。将收集到的有效成分通过PubChem 数据库获得对应的SMILES 号，然后把SMILES 号输入Swiss 数据库(Swiss Target Prediction)进行靶点预测，收集各个成分预测出的Possibility 大于0 的靶点，最后去重得到有效成分的靶点。

1.2 疾病靶点的预测

在GeneCards 数据库(https://www.genecards.org/)，TTD 数据库(http://bidd.nus.edu.sg/group/cjttd/)，DRUGBANK 数据库(https://www.drugbank.ca/)中检索“Alzheimer's disease”并获得与AD 相关的靶点。汇总收集的靶点，去重后得到与AD相关的靶点。

1.3 药物-成分-靶点图的构建

根据收集到的西红花有效成分和有效成分对应的靶点，使用Cytoscape 3.7.2 软件建立“西红花-成分-靶点”网络。网络中的药物、成分和靶点由节点表示，节点之间由边来连接，表示节点的相关性。

1.4 蛋白相互作用网络的构建

将收集到的有效成分靶点与AD 疾病靶点取交集，得到西红花有效成分抗AD 的靶点，将靶点导入String 数据库(https://string-db.org/)，进行PPI 网络构建，限定物种为“人”，其余参数为默认设置。将下载获得的TSV文件导入Cytoscape 3.7.2软件，应用“Net‐work Analyzer”功能进行网络拓扑分析，筛选自由度(度)值高于平均值的靶点作为关键靶点。然后使用在线韦恩图绘制工具(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)绘制西红花成分靶点和AD 靶点的韦恩图。

1.5 生物过程与代谢通路富集分析

将西红花有效成分抗AD 的靶点对应的基因输入DAVID，设置物种为“人类”进行基因生物功能学(GO)富集分析和KEGG 通路富集分析，借助微生信(http://www.bioinformatics.com.cn/)将结果用气泡图和条形图的形式表示。

1.6 成分-靶点分子对接

分子对接是评价药物活性成分与药物靶点结合能力的方法。利用Ledock 对关键通路的关键靶点APH1A、PSEN1、mTOR、AKT1 及其对应的化合物进行分子对接试验。利用TCMSP 下载化合物的mol2文件后，导入Chem 3D 软件,调整化合物空间构象，Minimize能量优化，保存为mol2 结构。从PDB(https://www.rcsb.org/)下载靶蛋白的3D 晶体结构，利用Pymol 获得对接盒子信息。利用Ledock 软件上传化合物和蛋白文件，输入盒子信息，将化合物以及对应靶蛋白对接，获取对接结果。利用Pymol对结果进行分析，得到化合物-靶蛋白对接图。

2 结果

2.1 西红花有效成分筛选结果

基于“1.1”的条件对西红花的有效成分进行筛选，最终筛选出7 个有效成分，见表1。通过Swiss 数据库得到共254个有效成分作用的靶点。

表1 西红花有效成分

2.2 AD疾病靶点的获得

取GeneCards 数据库前500 个与AD 有关的靶点，并在TTD、DRUGBAN 中找到所有与AD 有关的靶点，汇总去重后，最终获得631个靶点。

2.3 西红花-成分-靶点网络的构建和分析结果

使用Cytoscape3.7.2 软件建立“西红花-成分-靶点”的网络图（见图1），图中包含262 个节点，其中1个红色菱形节点为西红花，7 个绿色圆形节点为西红花的有效成分，24 个蓝色正方形节点为度值<4 的靶点，30 个黄色正方形节点为度值>4 的靶点。槲皮素、山柰酚、异鼠李素和正庚醛的度值较大，而度值较大的靶点有细胞周期蛋白依赖性激酶1(CDK1)、细胞周期蛋白依赖性激酶2(CDK2)、细胞色素P450 19A1(CYP19A1)、碳 酸 酐 酶IV(CA4)、醛糖酮还原酶 家 族1 成员B10(AKR1B10)、聚[ADP-核糖]聚合酶-1(PARP1)等，见表2。

表2 有效成分对应的靶点

图1 西红花药物-成分-靶点网络图

2.4 PPI网络互作结果

将有效成分作用的靶点与AD 相关靶点用韦恩图取交集，得到西红花有效成分抗AD 的71 个靶点（见图2）。将71 个靶点导入String 数据库获得PPI 网络数据，将数据导入Cytoscape 3.7.2 软件中构建PPI网络，见图3。该网络共涉及70 个靶点（有1 个预测靶点无任何关联）和550 条边。筛选出了度值高于平均值的28 个核心靶点，见表3。在PPI 网络中度值由小到大，则节点和边都逐渐增大，颜色都由红变蓝，PPI 网络显示，以AKT1、IL6、TNF、APP、HSP90AA1、SRC、MAPK8、PTGS2等节点为中心，且度值较高。

表3 PPI网络中的核心靶点

图2 西红花有效成分作用靶点与阿尔茨海默病相关靶点韦恩图

图3 西红花抗AD的PPI网络

2.5 生物过程与代谢通路富集

使用DAVID 对西红花有效成分抗AD 的71 个靶点进行GO 功能富集分析(P<0.05)和KEGG 通路富集分析，见图4、5。GO 功能富集分析结果显示，在生物过程方面，这些靶点主要富集在凋亡的正向和负向调控、蛋白质磷酸化、RNA 聚合酶II 启动子转录的正调控等过程上。在细胞组分方面，这些靶点主要富集在细胞质膜、细胞质、细胞核、胞浆、线粒体、细胞外间隙和外泌体等处。在分子功能方面，这些靶点主要与蛋白质、ATP和酶结合，具有蛋白激酶活性。

图4 GO功能富集分析结果

KEGG 富集分析结果显示，靶点主要富集在AD的通路和信号传导的通路上。与信号传导的通路主要有催乳素信号通路、VEGF信号通路、FcεRI信号通路、雌激素信号通路、TNF 信号通路以及ErbB 信号通路。其中，基因富集数量最多的通路为Alzheimer's disease（阿尔茨海默病），共有14 个基因富集在该通路上,分别为PSENEN、GSK3β、APP、PSEN2、PSEN1、TNF、APH1A、BACE1、NCSTN、APH1B、CDK5、MAPT、NOS1以及CDK5R1。

2.6 分子对接验证网络药理学

阿尔茨海默病通路的关键靶点为APH1A、APH1B、PSEN1、PSEN2，胰岛素抵抗通路的关键靶点为mTOR、AKT1。其中APH1B 和PSEN2 无法从PDB 数据库得到PDB 文件。我们对4 个关键靶点与度值排名较前的正庚醛、异鼠李素、槲皮素和山柰酚中对应的药物成分进行分子对接，结果见表4。

表4 关键靶点及其对应化合物分子对接结果

分子对接得分代表分子对接吻合度，分数越小代表配体与受体蛋白结合性越好，发生作用的可能性越大。可见，关键靶蛋白与有效成分的结合能均远远低于-5.0 KJ/mol。对其进一步分析，得到各靶点与成分的3D 结合模型（见图6）。化合物-靶蛋白对接图也显示化合物和靶蛋白能形成氢键等分子间作用力，进一步说明了筛选结果的可靠性。

图5 KEGG分析的10条通路气泡图

图6 各靶点与药物成分相互作用的分子对接示意图

3 讨论

从本文表1 中可发现，槲皮素、异鼠李素、山柰酚、正庚醛的度值较大，提示这些成分可能与西红花治疗AD 的潜力有关。Mohammad 等[18]报道，在淀粉样蛋白-β 注射引起的AD 大鼠模型中，槲皮素不仅促进脑源性神经营养因子和神经生长因子的表达，还能促进成体神经的发生，提示其在减轻AD 症状方面发挥着重要的作用。有研究表明，山柰酚可通过抑制神经炎症以及保护血脑屏障来改善大鼠脑缺血再灌注神经功能[19]。但正庚醛在AD 的作用尚未见文献报道，而在分子对接的结果中，正庚醛与多个靶点都具有较强的结合活性，以上数据可为AD 的新的治疗途径和靶点提供预测依据。

KEGG 通路富集分析显示，西红花与AD 的共同靶点(PIK3CA、AKT1、PIK3R1、mTOR 等)富集在胰岛素抵抗(Insulin resistance,IR)通路。我们推断，西红花的有效成分可以通过影响IR通路间接影响AD 症状。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapa‐mycin,mTOR)位于IR 通路的中心环节[20],可能是治疗AD 的一个重要的靶点。有研究显示，患有AD 的大鼠中，mTOR 的高表达与Aβ 淀粉样蛋白的发生和tau蛋白过度磷酸化有着密切的联系；使用Aβ抑制剂后，mTOR 的表达程度也受到抑制；同时mTOR 的下调也促使tau蛋白的合成[21]。目前有研究证明，在AD发病的早期，AKT1 激酶活性的丧失和AKT1 信号通路的抑制，导致突触神经体中的活性依赖性翻译受到抑制[22]。也有研究表明AKT1-mTOR 是局部树突状蛋白翻译的关键成分，而这一蛋白对神经的可塑性起到关键的作用[23]。伍艳军等[24]以电针的方式对AD 模型APP/PS1 双转基因小鼠进行刺激后，发现小鼠皮质内PI3K1A 的P85α、P110α 亚基等蛋白的表达水平降低，并减少皮质内老年斑的产生。从以上实验结果和我们的数据分析可推测，PI3K/AKT/mTOR 通路是影响AD产生的重要因素，其过度激活时会改变自噬水平，加剧AD 的症状[25]。西红花苷可通过调节PI3K/AKT/mTOR 通路的激活程度来治疗神经退行性病变[26]。异鼠李素能影响AKT 的多个通路，进而发挥糖尿病和神经退行性变的治疗效果[27]。综上，我们认为，西红花可能具有通过胰岛素抵抗和PI3K/AKT/mTOR通路治疗或改善AD的能力。

PPI 网络互作结果与KEGG 富集分析结果表明，靶点PSEN1、PSEN2、APH1A 和APH1B 与西红花某些有效活性成分相关，且这4 个靶点度值较大的同时，也富集在AD 的通路上。由此我们推测，西红花某些有效活性成分可以通过靶向PSEN1、PSEN2、APH1A 和APH1B 来介导AD 通路，从而改善AD 症状。淀粉样β肽(Aβ)是在β-分泌酶和γ-分泌酶连续切割淀粉样β 前体蛋白(APP)后产生的一种AD 的致病蛋白[28]。有研究显示，PSEN 相关基因PSEN1 和PSEN2可以干预Aβ 的过量产生[29]。另一方面，APH1基因编码的APH1A 和APH1B 也是γ－分泌酶复合体的重要组成部分[30]。有研究显示，APH1A 促进尼卡素与PS1 和早老素增强子-2 亚单位的结合，从而促进γ－分泌酶的形成[31]。APH1Bγ-分泌酶的特异性失活也导致AD相关表型特征的改善[32]。基于KEGG富集分析和上述研究结果，我们推测西红花的有效成分可通过靶向以上靶点来抑制γ-分泌酶的活性，最终改善AD。虽然上述研究结果为本研究提供了理论依据，但西红花有效成分作用PSEN1、PSEN2、APH1A 和APH1B 靶点治疗AD 的相关机制仍需大量实验进一步验证。

尽管上文提到了不少西红花在AD 上的应用，但从本研究结果来看，仍有一些具有研究价值的靶点缺少足够实验证明，例如靶点INSR（胰岛素信号传导通路相关蛋白）。有研究认为，INSR 基因在AD 患者脑内不同区域的表达可能是近期临床诊断的新的标志物[33]。Lu 等[34]借助OSCAR 平台，预测INSR-Pax6-NQO1 通路可能通过抑制ROS 的形成来抵抗大脑衰老。近年对胰岛素受体与AD 的相关研究进一步说明了胰岛素及胰岛素受体与AD 有着非常密切的关系，这可能是未来治疗AD 的新的关键靶点之一。因此，下一步的研究或许可以通过实验探明西红花与INSR靶点的关系，从而进一步挖掘其在治疗AD上的应用潜力。

本研究应用网络药理学构建并分析成分-靶点-通路的互作关系，其结果既体现了AD 复杂的发病机制，也反映了西红花多成分、多靶点、多通路治疗AD的潜力。本研究为西红花治疗AD 的可能性提供理论基础，并尝试在其基础上提出新的治疗策略和研究思路。