果树逆境胁迫相关miRNA的研究进展

渠慎春,耿晓月,余心怡,曹丽芳

(南京农业大学园艺学院,江苏 南京 210095)

miRNA(microRNA)是一类来自真核生物、长度为18～24 nt的内源性非编码小分子RNA,由具有发卡结构的单链RNA前体剪切形成,在植物基因表达调控中发挥重要功能[1-2]。1993年miRNA lin-4在秀丽隐杆线虫(Caenorhabditiselegans)中首次被发现,但直到2002年第1个植物miRNA才在拟南芥中被发现[3-4]。miRNA通过与目标mRNA特异性碱基配对,对其目标mRNA切割降解或翻译抑制,从而发挥转录后的负调控功能[5]。miRNA的目标基因多为转录因子,主要参与植物的生长发育、信号转导及响应逆境胁迫等基本生物过程[6]。植物在生长发育过程中会受到多种环境胁迫的影响,大多数生物和非生物胁迫会引起氧化胁迫,损伤细胞结构最终导致植物死亡[6]。miRNA介导植物防御的分子机制复杂而多样,既能调控寄主目标基因的表达,也能跨界操纵病原菌基因的表达[7]。

1 植物miRNA的合成及作用机制

1.1 植物miRNA的合成

植物miRNA由内源miRNA(MIR)基因编码,经过转录、加工和RNA诱导沉默复合体(RNA-induced silencing complex,RISC)过程。细胞核内MIR基因在RNA聚合酶Ⅱ的作用下转录形成具有5′端“帽子”和3′端ployA尾巴结构的初级产物pri-miRNA[8]。pri-miRNA结构中含有不完全的双链发夹特殊结构,该结构在Dicer-like 1(DCL1)酶及其辅助因子作用下被特异性识别并加工形成具有茎环发夹结构的前体pre-miRNA[9-10]。在DCL1等酶的作用下,pre-miRNA茎环结构被加工形成具有miRNA/miRNA*复合体结构的双链miRNA[11]。miRNA/miRNA*双链进一步由甲基转移酶(Hua enhancer 1,HEN1)在3′端甲基化以防止miRNA的降解。随后,Hasty(HST)转运蛋白将甲基化修饰的双链miRNA由细胞核转运至细胞质中。在解旋酶作用下,双链miRNA解旋形成2条单链,其中miRNA单链与Argonaute 1(AGO1)蛋白结合,进一步形成RNA诱导沉默复合体(RNA-induced silencing complex,RISC)复合体,通过碱基配对与目标mRNA结合,对其目标mRNA进行切割降解或翻译抑制[12];miRNA*链可能被降解,但在某些条件下,miRNA*也可能不被降解,发挥一定功能[13]。

1.2 植物miRNA的作用机制

在逆境胁迫下,植物miRNA不具有核酸酶功能,而是通过多种机制对基因进行转录后的表达调控[14]。miRNA对目标基因的调控方式以切割降解为主,少部分表现为翻译抑制[15]。当目标mRNA与miRNA完全互补配对时,在miRNA的介导下,RISC复合体特异性识别目标mRNA[16],引导AGO1蛋白上的具有RNaseH-like内切酶活性的PIWI结构域将其直接裂解,从而减少目标mRNA的积累。随后,miRNA参与的RISC复合体继续识别并切割其他目标mRNA。与动物不同,植物miRNA对目标基因的作用位点大部分位于其CDS区。也有证据表明,一些miRNA能够与目标mRNA的3′ 或5′ UTR区相结合来调控其表达。

当目标mRNA与miRNA之间存在一定错配时,植物miRNA能够抑制目标mRNA的翻译。目标基因的表达量变化在转录水平上不能直接被检测,只反映在蛋白水平上。miRNA对目标基因翻译的调控是通过抑制mRNA翻译起始过程实现的,这一过程也依赖AGO蛋白的存在。拟南芥膜整合蛋白Altered meristem programme 1(AMP1)位于内质网上,与AGO1以及一种外周蛋白形成复合物后,能够将目标mRNA从膜结合多聚核糖体上解除。迄今为止,只有AGO1和AGO10被证明在翻译抑制中发挥作用[17],在植物中并未找到更多有关miRNA参与调控目标基因蛋白合成的作用因子,miRNA介导目标mRNA翻译抑制的具体作用机制还有待进一步挖掘。

2 果树逆境胁迫相关的miRNA

果树在生长发育过程中会经历多种环境胁迫,影响其产量和果实品质,造成一定的经济损失。研究表明,miRNA在果树胁迫响应和抗逆性提高等方面扮演着重要的角色[18-19]。在逆境胁迫下,植物自身miRNA与AGO蛋白形成的RNA诱导沉默复合体,与目标mRNA互补配对结合,可以调节相应目标基因的表达,使下游抗逆相关基因的表达发生改变,进而影响相关代谢产物的生物合成,从而抵御逆境的胁迫[20]。在此过程中,一个miRNA可能调控多个目标基因[21],而一个目标基因也可受多个miRNA调控[22]。

2.1 果树生物胁迫相关miRNA

细菌、真菌、病毒和昆虫是影响果树生长发育的主要生物胁迫因素,它们可导致每年约30%的果树减产。果树体内大量miRNA会对生物胁迫做出响应,调控其目标基因的上调或下调表达[23],使果树的生理、生化和代谢过程发生相应变化[24]。

苹果中mdm-火疫病是由梨火疫欧式杆菌引起的一种细菌性病害。Kaja等[25]从苹果火疫病抗病品种和感病品种中得到12个小分子RNA文库并对其进行深度测序,发现mdm-miR169a、mdm-miR160e、mdm-miR167b-g和mdm-miR168a,b可能与苹果抗火疫病抗性有关;此外,还证明苹果中mdm-miR168a,b的目标基因是RNA诱导沉默复合体的核心组成成分AGO,其在苹果火疫病感病品种中表达量更高;而mdm-miR167b-g随着树体生长在苹果火疫病感病砧木中具有更高的表达量。mdm-miR169a、mdm-miR160e、mdm-miR167b-g和mdm-miR168a,b通过靶向应激反应蛋白参与应激反应,从而在抗火疫病中发挥重要作用[25]。苹果茎痘病毒(ASPV)是苹果和梨树最常见的病毒之一。Zhang等[26]发现‘杜梨’和‘红宝石’梨感染ASPV后pbr-miR156、pbr-miR164、pbr-miR399和pbr-miR482上调表达,它们的目标基因PyrusbretschneideriRibosomalproteinS6(pbRPS6)、PyrusbretschneideriNAM/ATAF/CUC(pbNAC)、PyrusbretschneideriToll-likereceptor(pbTLR)和PyrusbretschneideriRX-coiled-coil(pbRX-CC)在ASPV感染与无病毒株系中的表达没有显著差异,表明相应miRNA数量的增加抑制了ASPV抗性相关目标基因的表达,推测这些miRNA及其目标基因参与梨的病毒防御途径。虫害是影响果树生长发育的生物胁迫之一,化学杀虫剂的使用是控制虫害的主要方法。昆虫繁殖能力和适应性强、生命周期短,许多昆虫自身对化学杀虫剂具有抗性,这些因素导致虫害防治工作更加困难。miRNA可调节昆虫对化学杀虫剂的抗性,miR-1目标靶向GlutathioneS-transferasefamilymember4(GSTm4)影响朱砂叶螨对丁氟螨酯的抗性[27],而miR-2和miR-13调控CytochromeP4509J35(CYP9J35)和CytochromeP450325BG3(CYP325BG3)的表达,介导淡色库蚊对溴氰菊酯的抗性[28]。

真菌性病害是我国果树生产中的主要病害,严重制约着我国果树产业的发展。Nucleotidebindingsite-leucinrichrepeats(NBS-LRR)基因是抗病基因中最大的家族。Zhu等[29]通过小RNA深度测序发现桃miRNA目标基因中包括多个编码抗病蛋白的NBS-LRR基因,由此推测miRNA在桃的抗病性调控中发挥重要的作用。Ma等[30]研究发现,在40个对斑点落叶病抗性的苹果品种中,NBS-LRR基因在抗病品种‘金冠’中的表达量明显高于感病品种‘富士’,且与Md-miRLn11的表达呈相反趋势,说明在病原菌侵染下,Md-miRLn11可能通过抑制目标基因Md-NBS-LRR的表达来影响不同苹果品种对斑点落叶病的抗性。此外,Zhang等[31]利用高通量测序技术鉴定出一种novel miRNA,命名为Md-miRln20,其在苹果感病品种中的表达量显著高于抗病品种,而其目标基因Md-TN1-GLS则表现出相反的变化趋势,表明Md-miRln20和其目标基因的表达与苹果的炭疽叶枯病抗性密切相关,Md-miRln20通过抑制Md-TN1-GLS的表达负调控苹果对炭疽叶枯病的抗性。白粉病侵染草莓后,miR390与目的基因TransactingsiRNA3(TAS3)间的表达模式与拟南芥类似,因此推测草莓中也存在miR390-TAS3-ARF调控模块,miR390可能通过间接负调控Auxinresponsefactor(ARF)的表达来提高对白粉病的抗性[32]。白腐病是引起葡萄生长期果实腐烂的主要真菌病害。白腐病病原菌侵染后,刺葡萄中miR172a、miR172b、miR845a、novel_81和miR159a发生特异表达,这些miRNA的目标基因包括与抗病相关的WRKY、SQUAMOSApromoterbindingprotein-like(SPL)、EF-TUreceptor(EFR)等转录因子及Leucine-richrepeat(LRR)类抗病基因,可作为研究刺葡萄抗白腐病的目标[33]。香蕉受到香蕉枯萎病菌FOC4侵染后,miRNA159a、miRNA165a、miRNA399a的表达表现出明显的品种特异性和组织特异性[34];Song等[35]通过对小RNA进行转录组测序发现,香蕉枯萎病抗性品种与易感品种间部分miRNA表达差异十分显著,同时发现miRNA靶向枯萎病菌基因组中2个重要致病基因:阿魏酸酯酶基因(Feruloylesterase,FAE)和脯氨酸亚氨基肽酶基因(Prolineiminopeptidase,PIP),这为miRNA功能研究及miRNA与病原菌互作机制研究提供了良好的思路。

本课题组通过高通量测序技术在感病品种‘富士’苹果和抗性种质湖北海棠中得到了24个响应苹果轮纹病侵染的miRNA,并用荧光定量PCR手段鉴定了其中与胁迫相关的miR167、miR395、miR397和miR2111的表达模式,这些miRNA的表达在苹果轮纹病菌侵染的不同时期呈动态变化,初步鉴定这些miRNA可能在苹果对轮纹病防御过程中起重要作用[36]。进一步研究发现,miR397b可以调节与木质素生物合成相关基因MalushupehensisLaccase7(MhLAC7)的表达,在湖北海棠中对苹果轮纹病的抗性起到负调控作用[37]。

以上这些特定的miRNA途径是否仅限于特定果树树种与相应病原菌的侵害,或者是所有植物与病原菌之间相互作用的通用调节机制,目前尚不清楚。值得注意的是,本课题组研究发现,miR168和其目标基因AGO1(RISC的核心组分)的表达,在湖北海棠抵御轮纹病侵染的过程中受到精确而复杂的调控,miR168/AGO1表达稳态的改变会引起植株多种防御途径改变,对湖北海棠应对轮纹病的侵染起到重要作用[38]。

综上所述,这些特定果树miRNA参与植物防御功能机制的研究,为深入探索miRNA途径在植物生物胁迫应答中的重要调控作用奠定了基础。

2.2 果树非生物胁迫相关miRNA

2.2.1 干旱干旱胁迫会对果树的产量和品质造成严重影响。在干旱胁迫下,果树体内相关miRNA会出现差异性表达并调控其目标基因,从而适应干旱环境。干旱胁迫可以诱导葡萄miR393在根部特异表达上调,并在侧根生长适应干旱胁迫的过程中发挥重要作用,在miR393启动子区域存在特定的干旱诱导顺式元件,在拟南芥中,miR393调控Transportinhibitorresponse1/AuxinSignalingF-box2(TIR1/AFB2)的表达[39],但在葡萄叶片中miR393仅负调控TIR1-like基因,说明在葡萄的根部,可能存在其他胁迫诱导调控机制干扰miRNA抑制活性[40]。香蕉驯化干旱处理和直接干旱处理试验结果表明,驯化干旱处理后miRNA的表达量高于直接干旱处理,同时miR160a和miR164a的表达量显著高于其他miRNA,说明这 2个 miRNA可能在香蕉抗旱过程中扮演重要角色[41-42]。西藏沙棘中2种新型miRNA(novel_miR_24和novel_miR_87)在正常生长情况下的表达水平与在干旱胁迫下的表达水平存在明显差异,它们的靶基因参与细胞代谢和应激反应,可用于提高西藏沙棘及其他高原植物的耐旱性[43]。

2.2.2 冷害目前,果树中已有较多的miRNA被证实在温度胁迫中起到重要的调控作用。Liu等[44]通过高通量测序发现在野生香蕉中miR172、miR395和miR408对冷胁迫发生应激反应,说明这些miRNA可能在冷胁迫中发挥关键作用;同时,对miRNA目标位点的基因本体论(gene ontology,GO)和京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)分析表明,miR172可能在冷胁迫反应中发挥中心协调作用,特别是在蛋白激酶CK2(Casein kinase 2)和昼夜节律调节中。Late embryogenesis abundant(LEA)蛋白可以在冷胁迫下保护细胞内的蛋白和DNA并提高植物抗冻能力[45],而domain containing protein(NAC)家族转录因子通过调节C-repeat binding factor(CBF)相关途径参与耐寒性调控[46]。冷胁迫下,葡萄中miR172a表达上调,miR164b和miR535a表达下调,miR535a、miR172a、miR164b分别靶向LEA蛋白、Apetala 2(AP2)乙烯应答转录因子和NAC转录因子[47]。相对于桃幼叶组织,miR156、miR164、miR172、miR393、miR396、miR414和miR2275在冬芽中有特异性表达[48],表明这些miRNA可能对低温胁迫有调控作用。

2.2.3 盐胁迫果树是对盐胁迫比较敏感的植物,盐胁迫对果树种子萌发、生长发育和产量造成不同程度的影响[49]。在盐胁迫下,柑橘根系中有76个miRNA和2 574个mRNA存在差异表达,这些基因在功能上与碳水化合物代谢、激素信号转导、reactive oxygen species(ROS)系统和苯丙氨酸代谢有关,NAC、MYB domain protein(MYB)、C-repeat-binding factor(CBF)、ethylene response factors(ERF)、WRKY DNA-binding protein(WRKY)、zinc finger protein(ZFP)、calmodulin-binding protein(CAMTA)、basic-leucine zipper protein(bZIP)等转录因子参与盐胁迫过程,其中大部分显著上调表达,而少数miRNA靶向的转录因子下调表达[50]。Yaish等[51]研究发现,在盐胁迫下枣椰树中miRNA表达存在差异,在叶片中,54个已鉴定的miRNA受到显著影响,其中70%的miRNA表达上调;而在根中,25个已鉴定的miRNA受到显著影响,其中76%的miRNA表达上调,miRNA的靶点如钾离子通道Arabidopsis K+transporter 2-like(AKT2-like)蛋白、液泡蛋白筛选相关蛋白、钙依赖性蛋白等已报道与耐盐相关。Li等[52]发现,草莓果实受到盐胁迫6 h后,Fan-miR73表达量明显下降,而目标基因ABA-insensitive5(ABI5)表达量上调,说明Fan-miR73在草莓盐胁迫中发挥重要调控作用。

2.2.4 营养元素缺失果树在生长发育过程中各个阶段对营养元素的需求不同,营养元素的缺乏也是果树生长发育过程经常遇到的胁迫问题。miRNA通过调控目标基因的表达来调节相关营养元素的代谢。研究表明草莓果实可溶性固形物含量与磷含量呈正相关,低磷胁迫诱导草莓miR399a的积累,调节植株磷平衡,以改善果实品质[53];同时,miRNA可以通过改变根系结构,提高磷的转运和再利用效率,参与花青素和抗氧化物生物合成等来响应低磷胁迫[54]。Liang等[55]经Illumina测序发现柑橘中miR158、miR1044、miR1151、miR5261、miR6190和miR6485通过表达上调来减轻Mg胁迫。铁胁迫诱导小金海棠miR394a在根部和叶片中表达上调,但其表达模式不同;miR394a在根系中反应迅速而在叶片中反应相对较慢,缺铁时根部首先发生缺铁反应产生局部信号,信号传至地上部,引起地上部miR394a的表达从而使地上部更耐缺铁[56]。葡萄vvi-miR398能介导Copper/zincsuperoxidedismutase2(CSD2)基因的裂解,通过转基因等手段对CSD2进行功能验证,发现在烟草中过表达葡萄CSD2能提高植株的铜胁迫抗性[57];此外vvi-miR160和vvi-miR167在铜胁迫下受到抑制,其目标基因ARF可能通过充当信号分子参与铜胁迫[58]。

3 展望

miRNA约占总基因的1%,这意味着还有许多miRNA尚未发现[59]。近年来,随着对植物miRNA的深入研究,大量参与植物生物和非生物胁迫的miRNA被发现并鉴定出其功能。果树在生长发育过程中会遇到很多生物和非生物胁迫,其中病原菌的胁迫可能是毁灭性的[60]。大多数果树树种基因组高度杂合,遗传背景非常复杂,采用常规的基因工程育种手段,常常面临转化效率低且外源基因表达不稳定的问题,难以获得生产所需的稳定一致的优良抗性新品系。因此在生产中,应从miRNA入手,从抗性基因表达调控的角度,引入和发展新的基因操作手段,在果树抗逆育种方面具有广泛的应用前景。

目前miRNA参与植物抗逆的相关报道主要集中在拟南芥等模式植物中,而在果树等经济作物中报道相对较少。随着越来越多特定果树miRNA的挖掘和功能的深入研究,miRNA途径在果树抗性调控中的重要作用将会进一步明确,这将有助于深入了解逆境胁迫下果树防御途径的多层次调控机制,为果树抗性育种和品种改良提供理论依据。