鱼油酶法水解及酯交换反应中脂肪酶活力检测方法的研究
2021-12-22许曦锃
江 洲,许曦锃,傅 红*
(1.福建天马科技集团股份有限公司,福建省特种水产配合饲料重点实验室,福建 福清350308; 2.福州大学生物科学与工程学院,福建 福州 350108)
脂肪酶是一种能够催化中长碳链酯类的酯键发生断裂与逆向合成的生物催化剂[1],在油脂加工等领域应用前景广阔。利用脂肪酶进行酶法酯交换反应以提高鱼油甘油三酯原料的ω-3功能性脂肪酸含量,是近年来食品和饲料行业的研究热点[2-6]。准确测定酶活力这一关键性指标,对脂肪酶在鱼油产业上的应用具有重要意义。
目前,脂肪酶活力的检测主要有酸碱滴定法、紫外分光光度法、气相色谱分析法、界面张力法、浊度法、酶联免疫吸附法等[7-12],虽然酶活力检测方法众多,但每种方法的底物条件和操作条件各不相同,影响了结果的准确性和可比性。而且,商业化脂肪酶的酶活力检测方法大多基于其水解反应活力,即检测其水解相应底物的消耗量或者产物的生成量来表征酶活力大小。虽然理论上脂肪酶可以催化水解和酯化两个可逆反应,但某些具有很高水解活性的脂肪酶在非水相中可能无法表现出同样能力的合成活性[13]。鱼油酯交换反应属于非水相催化反应,水解酶活力可能不足以全面准确地反映其在非水相催化反应中的酶活力特性。因此,本研究选用8种商品化脂肪酶,通过对比酸碱滴定法、分光光度法、气相色谱法等多种酶活力的传统检测方法,选择适用于水解和酯交换两种反应体系的酶活力检测方法,并分别应用于鱼油酶法水解和酯交换反应体系,为高酶活脂肪酶在鱼油工业中的应用奠定研究基础。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
游离脂肪酶L1、L2、L3、L4:福建百特生物科技有限公司;L5:猪胰脂酶,购于合肥博美生物技术有限公司;固定化酶L6、L7、L8分别是Novozyme 435、Lipozyme TL IM和Lipozyme RM IM,购于丹麦诺维信公司。鱼油原料、鱼油乙酯:福建天马科技集团股份有限公司;薄层层析硅胶G为分析纯:青岛海洋化工有限公司;对硝基苯酚、对硝基苯酚棕榈酸酯为分析纯:麦克林生化科技有限公司;三油酸甘油酯、正辛酸等均为分析纯:国药集团化学试剂有限公司。
1.2 仪器与设备
GC7890A气相色谱仪、112-88A7HP-88毛细管色谱柱:美国Agilent公司;T6-X紫外分光光度计:北京普析通用仪器有限公司;ZD-2自动电位滴定仪:上海精密科学仪器有限公司;HH-501超级恒温水浴锅、HJ-4A磁力搅拌器:上海方瑞仪器有限公司;FA25型高剪切分散乳化机:上海FLUKO公司;CF16RX-Ⅱ高速冷冻离心机:天美(中国)科学仪器有限公司;RE52-2旋转蒸发仪:上海沪西分析仪器厂有限公司。
1.3 脂肪酶活力的测定
1.3.1 聚乙烯醇-橄榄油乳化法测定水解活力
通过聚乙烯醇和橄榄油的乳化体系,采用电位滴定法测定脂肪酶的水解活力[14],一个水解活力单位(U)为脂肪酶1 min内水解底物所释放1 μmol对硝基苯酚所需的酶量。
1.3.2 对硝基苯酚法测定水解活力
以棕榈酸对硝基苯酯(p-NPP)和水为底物、Tris-HCl为缓冲液,采用比色法测定脂肪酶水解产物对硝基苯酚含量[15]。一个水解活力单位(U)为脂肪酶1 min水解底物所释放1 μmol对硝基苯酚所需的酶量。
1.3.3 正辛酸-三油酸甘油酯交换法测定酯交换活力
以三油酸甘油酯与正辛酸作为底物,在脂肪酶的催化下进行酰基转移反应,将正辛酸置换到甘油酯的链上,采用气相色谱分析法测定脂肪酶的酯交换活力[16]。一个酯交换活力单位(U)为脂肪酶1 min催化l μg正辛酸转移到三油酸甘油酯中所需的酶量。
1.3.4 对硝基苯酚法测定酯交换活力
以棕榈酸对硝基苯(p-NPP)和乙醇为底物,在脂肪酶的催化下进行酯交换反应,采用比色法测定产物对硝基苯酚含量[17]。一个酯交换活力单位(U)为脂肪酶1 min酯交换底物生成1 μmol对硝基苯酚所需的酶量。
1.4 酶促水解制备脂肪酸型鱼油
将甘油三酯鱼油与一定pH的磷酸缓冲溶液以2∶3的体积比混合,加入适量脂肪酶混合均匀,在酶的最适温度和一定搅拌速度下水浴反应16 h。待反应结束后,萃取上层鱼油,除去溶剂和水分,收集脂肪酸型鱼油混合物,待测[18]。
1.5 脂肪酶催化鱼油酯交换反应
将鱼油甘油酯原料、鱼油乙酯和适量脂肪酶在烧杯中混匀反应。加入丙酮终止反应,离心除酶,用薄层层析法分离出甘油三酯,经正己烷萃取后甲酯化,利用气相色谱仪测定TG型鱼油中二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)含量[19-20]。
脂肪酸组分的气相色谱分析条件[21]:载气为纯氮气,流速为1 mL/min,氢气35 mL/min,空气350 mL/min;进样口温度250°C,FID检测器280°C。程序升温:140°C保持5 min,以4°C/min程序升温到220°C持续保持35 min。
1.6 数据处理
所有试验均重复测定3次,利用SPSS 19软件进行数据统计分析,P<0.05表明存在显著性差异。
2 结果与分析
2.1 脂肪酶水解活力检测方法的选择
8种商业化脂肪酶的产品包装上原标识酶活如表1所示。采用聚乙烯醇-橄榄油乳化法测得的脂肪酶水解活力如图1所示。结果表明,以橄榄油作为底物,游离脂肪酶中的L1、L3、L5的水解活力比较高,其中水解活力最高的是L5猪胰脂酶,达到97 500 U/g。固定化脂肪酶中,L8的水解活力为90 667 U/g,远远高于L6和L7的水解活力。
注:L1代表游离脂肪酶1;L2代表游离脂肪酶2;L3代表游离脂肪酶3;L4代表游离脂肪酶4;L5代表猪胰脂酶;L6代表Novozyme 435;L7代表Lipozyme TL IM;L8代表Lipozyme RM IM。下同。
Notes:L1~L4 represented the free lipase 1~the free lipase 4,respectively;L5 represented porcine pancreatic lipase;L6 represented Novozyme 435;L7 represented Lipozyme TL IM;L8 represented Lipozyme RM IM.The same as below.
对硝基苯酚法测得的脂肪酶水解活力如图2所示。结果显示,游离脂肪酶L2、L3、L5的水解活力较高,L4最低;而固定化脂肪酶中L8为522 U/g,高于L6和L7,这与聚乙烯醇-橄榄油乳化法测得的总体趋势相似。但是,对硝基苯酚法测得水解活力最高的是L2,为34 942 U/g,与聚乙烯醇-橄榄油乳化法存在偏差。
聚乙烯醇-橄榄油乳化法和对硝基苯酚法两种方法的实测水解酶活力相对标准偏差值(RSD),如表1所示。从结果看出,聚乙烯醇-橄榄油乳化法的相对标准偏差基本在10%以下,显著小于对硝基苯酚法。这可能是在橄榄油乳化体系中采用的均质乳化提高了酶与底物相互作用的表面积,使脂肪酶充分接触油水界面,促进滴定结果较稳定,相对标准偏差较小。另一方面,从反应的底物特征看,和棕榈酸对硝基苯相比,橄榄油与鱼油水解和酯交换反应的原料天然鱼油甘油三酯的分子结构更接近,能够更准确地反映酶法反应中的底物特征。因此,聚乙烯醇-橄榄油乳化法更适用于筛选鱼油水解反应所需的高酶活特性所需的脂肪酶。
表1 不同方法测得脂肪酶水解活力和酯交换活力的相对标准偏差(RSD)
2.2 脂肪酶酯交换活力检测方法的选择
正辛酸-三油酸甘油酯交换法测定酯交换活力法是通过脂肪酶在非水相体系中酶促酯交换,使正辛酸和三油酸甘油酯发生酰基转移,通过气相色谱分析甘油酯中正辛酸的结合率反映酯交换活力[14]。该法测得8种脂肪酶的酯交换活力如图3所示。结果显示,固定化脂肪酶L6、L7、L8的酯交换活力高,L7和L8分别达到32 663 U/g 和19 933 U/g,但是游离脂肪酶的酯交换活力都较低,其中L1的酯交换活力高于其他游离脂肪酶。
对硝基苯酚法测得8种脂肪酶的酯交换活力,如图4所示。结果显示较高的是固定化脂肪酶L8和L6,分别为8.10 U/g和3.92 U/g,其他脂肪酶的酯交换活力都较低。
正辛酸-三油酸甘油酯交换法和对硝基苯酚法两种方法测得的酯交换脂肪酶的酶活力值存在差异,但主要与实验方法有关。酯交换反应基于不同的反应底物和类型,正辛酸-三油酸甘油酯交换法是脂肪酸与甘油酯类的酰基交换反应,对硝基苯酚法是醇与酯类的酰基转移反应,在酶活力的检测应用上,正辛酸-三油酸甘油酯交换法显然更接近于鱼油的酯交换反应底物特征,并且此法中的薄层层析法除酸效果好,不易影响气相色谱对辛酸结合率的测定,使得灵敏度高,结果较为准确;而对硝基苯酚法虽然操作简便,但萃取时间较长,目标产物易分解,这也导致了正辛酸-三油酸甘油酯交换法相对标准偏差远远小于对硝基苯酚法(表1)。
2.3 脂肪酶的水解和酯交换活力的相关性
对比上述几种脂肪酶活力的测定方法,确定了脂肪酶水解活力的测定采用聚乙烯醇-橄榄油乳化法,酯交换活力的测定采用正辛酸-三油酸甘油酯交换法。将两种脂肪酶活力值用多种相关数学模型进行两两拟合,探究其水解活力(x)和酯交换活力(y)之间的关系,结果发现其线性模型拟合方程为y=-0.083 5x+ 17 065.6,相关系数R2为0.071 5;幂指数拟合模型y=48 957.1x-0.156,相关系数R2为0.151 3;指数函数的单指数衰减拟合模型y=8 192.1+16 418.4e(-x/2 223),相关系数R2为0.204 0。上述拟合曲线方程及相关系数显示,酯交换活力大致随水解活力的增大而减小,总体近似于负相关关系。这和Wu X Y等[22]在催化酯合成中发现脂肪酶粗酶液的水解活性和酯化活性相关系数较小的结果相一致。因此,在脂肪酶活力实际测定时,水解活力不能反映酯交换活力,两者之间不能相互预测,实践中需要对两种酶活力逐一测定。
2.4 脂肪酶在脂肪酸型及酯交换型鱼油产品中的应用
选择3种高水解活力的脂肪酶L1、L3、L5,利用酶促水解甘油三酯型精制鱼油制备脂肪酸型鱼油产品,其中原料鱼油甘油酯的酸价为4.43 mg KOH/g;另选3种酯交换活力较高的脂肪酶L6、L7、L8,制备脂肪酸甘油三酯型鱼油产品,反应原料是甘油三酯型原料鱼油和乙酯型精制鱼油,两者的EPA和DHA的总含量分别为29.5%和71.5%。从表2中可以看出,三种脂肪酸型鱼油的酸价是水解前的25~30倍,其中L5脂肪酶水解鱼油产物酸价达到137.61 mg KOH/g;鱼油酯交换产物甘油三酯中EPA和DHA含量大大提高,其中固定化酶L8的富集效果最好,EPA和DHA总含量为55.38%,比原料鱼油提高了26%。上述鱼油产品中脂肪酶水解活力和酯交换活力的次序能够和图1、图3结果相对应,说明聚乙烯醇-橄榄油乳化法和正辛酸-三油酸甘油酯交换法分别适合于筛选鱼油水解和酯交换反应所需的脂肪酶。
表2 脂肪酸型及酯交换型鱼油产品应用
3 结论
以8种商品化脂肪酶为原料,研究适合于鱼油水解反应和酯交换反应的脂肪酶及其酶活检测方法,统一酶活力单位为U/g。通过对比聚乙烯醇-橄榄油乳化法和对硝基苯酚法测定脂肪酶的水解活力的相对标准偏差值可知,聚乙烯醇-橄榄油乳化法更适合于筛选鱼油水解反应所需的高酶活的脂肪酶。通过对比正辛酸-三油酸甘油酯交换法和对硝基苯酚法测定脂肪酶酯交换活力的相对标准偏差值可知,正辛酸-三油酸甘油酯交换法更适合于筛选鱼油酯交换反应所需的脂肪酶。一元一次线性模型、幂指数拟合模型和指数函数模型拟合显示,水解酶活和酯交换酶活的相关系数值R2在0.07~0.20之间,两者无显著性相关,表明脂肪酶水解活力不能反映酯交换活力;聚乙烯醇-橄榄油乳化法和正辛酸-三油酸甘油酯交换法两种酶活检测方法分别应用于鱼油水解和酯交换反应脂肪酶的效果良好。