基于代谢组学的抽动障碍患儿尿液生物标志物研究

韩枝彤，陈自佳，王素梅，吴欣瑜

(1. 北京中医药大学第二临床医学院，北京 100078；2. 北京中医药大学东方医院，北京 100078)

抽动障碍是一种以身体任何部位的一组或一群肌肉发生的不自主、快速、重复的收缩和(或)发声为主要特征的综合征[1]。抽动障碍大多数起病年龄为2～15岁，以5～10岁最多见，其病情通常在10～12岁最为严重，男孩明显多于女孩，男女比例可达(3～4)∶1[2]。根据患儿发病年龄、临床表现、病程长短和是否伴有发声抽动主要分为短暂性抽动障碍、慢性运动或发声抽动障碍、抽动秽语综合征(TS)。据报道，抽动障碍患病率达0.5%～1%[1]，共患注意缺陷多动障碍、强迫障碍、抑郁、焦虑、学习困难、适应困难等精神障碍的发生率是正常儿童的5～10倍[3]，共患率可高达85.7%[4]。19世纪60年代以前抽动障碍一直被视为原因不明、罕见、可自愈性疾病，但随着其患病率的增加，正成为危害儿童健康的常见严重慢性疾病之一。抽动障碍目前病因及发病机制尚未完全明确，亦缺乏特异性诊断指标，为其进一步研究及临床治疗带来一定的影响。本实验运用代谢组学方法对抽动障碍患儿尿液特异性生物标记物进行分析，揭示抽动障碍患儿独特的代谢图谱，客观阐述抽动障碍发病的实质和内涵，从而为抽动障碍的研究、药物开发等提供依据。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2019年10月—2020年3月北京中医药大学东方医院儿科门诊明确诊断为抽动障碍的患儿30例作为抽动障碍组，其中男23例，女7例，年龄3～12(7.3±3.2)岁。入选患儿均符合美国精神医学学会出版的《精神疾病诊断与统计手册》第5版(DSM-Ⅴ)中抽动障碍诊断标准，家属知情并同意参加本研究(10岁以上的患儿需经本人知情同意)；排除合并风湿性舞蹈病、手足徐动症、癫痫等其他神经系统疾病者，合并严重的心、脑、肝、肾、造血等系统疾病者，正在参加其他药物的临床试验者。选择同一时期在医院体检、与患儿无血缘关系的健康儿童30例作为正常组，男19例，女11例，年龄(6.6±2.7)岁。2组年龄、性别比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。

1.2仪器和试剂 UPLC-Q-TOF-MS(Synapt G2，Waters，USA)；Milli-Q超纯水系统(Millipore，Bedford，MA，USA)。甲醇、乙腈和甲酸为MS级，购自美国Fisher公司。采用Milli-Q超纯水系统(Millipore，Bedford，MA，USA)制备纯化水。

1.3尿样采集及处理 采集2组受检者中段晨尿5 mL，保存于-80 ℃冰箱内。将冻存的尿液在室温下复苏，取尿液100 μL，加入400 μL甲醇，涡旋混匀后置于混合仪2 000 r/min作用10 min混匀。4 ℃、12 000 r/min条件下离心10 min，取上清液400 μL氮气下吹干。残渣用100 μL甲醇溶解，4 ℃、12 000 r/min条件下离心10 min，精密吸取上清液70 μL进样分析。

1.4检测方法 采用液-质联用技术(LC-MS)、气-质联用技术(GC-MS)和化学计量学分析研究技术对2组受检者尿液进行检测。

1.4.1色谱条件 Waters Acquity BEH C18色谱柱(50 mm×2.1 mm，1.7 μm)，流动相为乙腈-甲酸-水体系梯度洗脱：0.1%甲酸水溶液A，0.1%甲酸乙腈B；流速：0.4 mL/min；0～20 min 5%B～95%B；20.1～25 min 95%B；25.1～30 min 5%B。

1.4.2质谱条件 毛细管电压3 kV，锥孔电压40 V，离子源温度120 ℃，脱溶剂温度设置500 ℃，脱溶剂气流速800 L/h，亮氨酸脑啡肽(LE)进行质量校对，正离子556.2771，负离子554.2615。质谱正、负离子模式扫描，进样量2.0 μL。

1.4.3方法学考察 质量控制样本(Quality Control，QC)由所有尿液样品中取5 μL进行等量混合，涡旋混匀后置于混合仪2 000 r/min作用10 min混匀。4 ℃、12 000 r/min条件下离心10 min，取离心后的上清液混匀制得。仪器精密度考察：取QC样品，按尿液样品前处理项下方法制备尿液样品，通过同一份样品平行进样6次，考察仪器的精密度(峰面积A、保留时间tR和质荷比m/z)，当RSD≤10%时，说明仪器精密度良好。 操作重复性考察： 取QC样品，依据尿液样品前处理项下方法，平行制备6份尿液样品，每份样品进样一针，计算特征离子色谱峰保留时间、质核比和提取离子色谱峰峰面积的RSD值，考察操作的重复性。当RSD≤15%时，说明操作重复性良好。 系统稳定性考察 ：取QC样品，按尿液样品前处理项下方法，平行制备多份尿液样品，通过连续5次测定QC样品，使系统达到平衡后，每隔10个样品进样一针，计算各个特征离子色谱峰保留时间、质核比和提取离子色谱峰峰面积的RSD值，考察系统稳定性。当RSD≤20%时，说明系统稳定性良好。

1.5数据处理 通过尿液样本的UPLC Q-TOF/MS谱分析，获得正、负离子检测模式的UPLC Q-TOF/MS原始数据。釆用Waters公司UPLC Q-TOF/MS系统软件，将原始数据导入操作软件MassLynx V4.0中的MarkerLynx软件包行数据预处理，该软件包能够自动完成滤除噪声、峰识别、重叠峰解析、峰对齐、峰匹配等前处理程序。然后将矩阵经过离子强度标准化后导入多变量统计软件EZinfo(Waters Corporation，Milford，MA，USA)进行主成分分析法(PCA)和正交偏最小二乘判别分析FAB(OPLS-DA)筛选潜在生物标志物。

1.6差异代谢物鉴定及代谢途径分析 根据MSE数据采集到的碎片裂解信息及精确质量数寻找可能的差异化合物，经HMDB数据库对差异化合物的离子质和比进行筛选，表明可能的物质及结构。最后结合代谢组学相关数据库METLIN、KEGG、LIPID MAPS及Chempider进行搜索比对，鉴定筛选出的化合物结构。将最终发现的差异化合物代入MetaboAnalyst网站用于整合代谢途径分析。

2 结 果

2.1生物代谢产物分析结果

2.1.1抽动障碍组与正常组的PCA得分散点图正、负离子模式下的样本均在99%置信区间内。在正、负离子模式下，抽动障碍组和正常组的样本有分开的趋势，说明疾病导致体内代谢差异出现，且在正离子模式下差异更为显著。见图1及图2。

图1 基于UPLC Q-TOP/MS数据的正离子模式下PCA图(1为正常组， 2为抽动障碍组)

图2 基于UPLC Q-TOP/MS数据的负离子模式下PCA图(1为正常组， 2为抽动障碍组)

2.1.2抽动障碍组与正常组的LoadingPlot图LoadingPlot图中的点为样品中的组分产生的信号，越靠外的点表示样品间含量差异越大。LoadingPlot中的标志物在Scores Plot图中相同位置的样品中的含量是最高的。见图3及图4。

图3 基于UPLC Q-TOP/MS数据的正离子模式下LoadingPlot图

图4 基于UPLC Q-TOP/MS数据的负离子模式下LoadingPlot图

2.1.3抽动障碍组与正常组的S-plot图 根据得出的OPLS-DA模型进一步筛选差异化合物，对变量进行标准化后分别得到正、负离子模式下的抽动障碍组和正常组尿液的S-plot图，见图5及图6。图中每个点代表一种特定的小分子代谢物，代谢物距离中心点的距离与该物在模型中的重要性呈正相关，即越偏离中心为潜在生物标记物的可能性越大。计算OPLS-DA中的各化合物的VIP值，将符合VIP值>1且差异有统计学意义(P<0.05)的变量根据MSR得到的碎片信息及精确质量数进行代谢物的鉴定，并通过数据库搜索比对，筛选差异性小分子代谢物。正离子模式下差异物有对羟基苯乙酸、1-甲基组氨酸、4-吡啶氧酸、吲哚乙酸、4-吡啶氧酸、磷酸羟基丙酮酸、L-色氨酸、甘油磷酸乙醇胺等。负离子模式下差异物有N6-乙酰-L-赖氨酸、硫酸吲哚酯、胸腺嘧啶、甘露醇1-磷酸酯、黄原氨酸、皮质酮、N-乙酰-7-O-乙酰神经氨酸、17β-雌二醇3-硫酸盐-17-(β-D-葡萄糖醛酸)等。

图5 基于UPLC Q-TOP/MS数据的正离子模式下S-Plot图

图6 基于UPLC Q-TOP/MS数据的负离子模式下S-Plot图

2.2代谢通路分析 将差异性小分子代谢物进行代谢通路分析，见图7及图8。图中横坐标重要性，纵坐标显著性，越靠右、越靠上为越具有差异性的代谢通路。正离子模式下的代谢通路：抽动障碍患儿尿液代谢差异物主要涉及组氨酸代谢、半胱氨酸与蛋氨酸代谢、不饱和脂肪酸的生物合成、维生素B6代谢、视黄醇代谢等(图7从右至左，从上至下)。负离子模式下的代谢通路：抽动障碍患儿尿液代谢差异物主要涉及嘧啶代谢、嘌呤代谢、类固醇激素代谢(图8从右至左，从上至下)。

图7 正离子模式下代谢通路分析

图8 负离子模式下代谢通路分析

3 讨 论

抽动障碍病因复杂，机制欠明，其可能是神经遗传、神经生物、免疫、心理、社会及环境、感染等因素单独或联合作用的结果。目前，从神经生物学角度探讨抽动障碍的发病是研究的主流，而近年来对其的基础研究则逐渐进入瓶颈状态。作为系统生物学最下游的“组学”，代谢组学定量测量生物样本中全部代谢物的组成以及这些代谢物在内外刺激下的动态改变[5]，是整体性研究生物体系功能变化的重要学科分支[6]，目前已被应用于哮喘、肺炎、肥胖、新生儿脑炎等儿童疾病的早期诊断甚至个性化治疗、疾病预后判断等方面[7]。本研究首次选取抽动障碍患儿的尿液进行代谢组学分析，筛选出与疾病相关的生物标记物有50余种，主要涉及氨基酸代谢、不饱和脂肪酸的生物合成、类固醇激素代谢等代谢通路。氨基酸在体内的代谢主要分为两个方面：合成机体各组织的蛋白、酶和激素；通过脱氨作用、转氨作用等，形成嘌呤、嘧啶、激素等在肝脏中转化成尿素、尿酸等排出体外，或者转变成糖、脂类或再合成某些非必需氨基酸，也可以经过三羧酸循环氧化成二氧化碳和水，并释放能量。若氨基酸代谢失调，其合成蛋白、糖、脂类及排出尿素等过程受阻，导致营养物质不能及时地合成利用或者有害物质堆积，从而出现神经系统功能障碍、精神运动发育迟滞、抽搐等。不饱和脂肪酸是人体必需的脂肪酸，在保持细胞膜的相对流动性、酯化胆固醇、降低血液黏稠度、改善血液微循环等方面均有重要的生理功能。不饱和脂肪酸代谢生成的脂质调控介质对炎症的启动、发展、消退均具有重要的调节作用[8]。适度的或可控的炎症对于入侵病原微生物的清除以及受损组织的修复是必需的，然而过度的或不可控的炎症往往会导致病理性炎症反应发生，大大提高了各种感染性和代谢性疾病的发病风险。临床中发现很多抽动障碍患儿在感染后出现抽动症状，或原有抽动症状加重或反复，推测其发病、病情反复与感染后的自身免疫功能改变相关。亦有研究证实抽动大鼠血清和大脑纹状体组织中白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子(TNF-α)等炎性细胞因子含量显著增加[9]，而免疫功能改变、炎症因子增加的原因可能就与不饱和脂肪酸代谢异常有关。不饱和脂肪酸还参与调节类固醇代谢的许多关键酶的表达。类固醇激素是一类脂溶性激素，具有调节糖代谢和水盐代谢、抗炎、抗过敏等功能，在机体免疫调节等方面有明确的作用。通过尿液代谢组学研究所筛选的生物标记物及代谢通路，从不同的角度影响着抽动障碍的发生、发展，是抽动障碍进一步发作机制研究、药物开发的潜在靶点。

中医古籍文献中并无抽动障碍病名的记载，但以本病典型临床表现进行分类,可以归结为“慢惊风”“痉病”“抽搐”等范畴[10]。宋代钱乙曾在《小儿药证直诀》中提到:“凡病或新或久,皆引肝风,风动而止于头目,目属肝,肝风入于目,上下左右如风吹,不轻不重,儿不能任,故目连劄也。”明·王肯堂《证治准绳·幼科·慢惊》云:“水生肝木,木为风化,木克脾土,其瘫痪症状,两肩微耸,两手下垂,时腹动不已。”说明抽动障碍的发生与肝风密切相关。肝风病机复杂，机体诸脏诸腑均可致肝气不疏，肝木失和，郁而化风。王素梅教授从小儿“脾常不足，肝常有余”的生理特点出发，首先提出了抽动障碍的主要病机为脾虚肝亢，风痰内扰。小儿饮食不知自节，或恣食肥甘厚味，脾胃受损，失于健运，土虚木横，肝风内动。故可见患儿形体消瘦、面色萎黄、食欲下降、大便干稀不调等。此外，王素梅教授根据多年临床经验认为抽动障碍本源在肝，但基于中医学“整体观”思想，其辨证论治不可拘泥于肝、脾二脏，肺、肾二脏当考虑其中。肺为华盖，贮痰之器，外邪侵袭，首袭肺金，升发失司，外风引动内风，风痰胶结，流窜头面四肢，发为抽动，此类患儿常为感冒后反复或再发性抽动，抽动部位以头面部更为突出，如眨眼、挑眉、耸鼻、甩头、扭脖等表现。抽动障碍病程较长时，王师多考虑与肝肾阴虚有关。“五脏之伤，穷必及肾”，肝气不疏，肝病及肾，子病犯母；“肝常有余，肾常不足”，肾阴不足，水不涵木，母病及子，最终均导致肝阳上亢，阴虚阳浮，动风诸症。由此可见，“有诸内，必形诸外”，肺、脾、肾三脏与肝脏之间相互影响，在内机体脏腑有病，在外诸窍发为抽动。人体是一个内外紧密联系的整体，外界环境的变化直接或间接影响着机体相关脏腑，而脏腑之间也在相互影响。故而对于抽动障碍疾病的发生发展既要考虑到本脏，又要注意他脏，即中医学“整体观”思想。

代谢组学把生命体作为一个完整系统来研究，通过全面、定量测定机体体液内源性小分子化合物来了解人体代谢网络在疾病中的变化过程，从而整体、动态揭示复杂性疾病的可能发生机制[11]。代谢组学的关键在于其整体性和动态性，这与中医学的整体观思维颇为相似。中医学整体观主要从宏观和主观上对机体生命活动、病理、生理进行认识，代谢组学则在微观和客观上对机体物质基础进行研究，系统阐述机体受到病理、生理刺激后代谢产物的变化规律，揭示机体生命活动代谢本质的科学实质[12]。本研究从抽动障碍患儿的尿液中筛选出的主要生物标记物包括氨基酸代谢、不饱和脂肪酸的生物合成、类固醇激素代谢等代谢通路。氨基酸代谢以肝脏作为枢纽，机体内多种糖、脂质、激素、氨基酸、蛋白质等代谢都是在肝脏中进行的[13]。这一代谢过程在理论上与中医学中肺、脾、肾三脏与肝相互作用相似，脾脏在肺主治节作用下将饮食水谷转化为糖、脂质、激素、氨基酸、蛋白质等精微物质，后经肝脏疏泄于全身，终至肾脏排泄,生成尿液。若“肝失疏泄”即机体内多种糖、脂质、激素、氨基酸、蛋白质等代谢紊乱，则可影响到脾，导致饮食不调、腹胀便溏等“脾虚”症状；到肺，引发神疲乏力、易于感冒等“肺气虚”症状；亦或到肾，出现面色晦暗、遗尿尿频等“肾虚”症状。

综上可知，抽动障碍是一种儿童和青少年时期发病的神经精神类疾病，中医病因病机上涉及多个脏腑的相互作用，但尚缺乏科学理论依据。代谢组学作为系统生物学的研究组学，从整体上对生物体的功能水平进行探索，其方法的应用为中医学“整体观念”的科学内涵提供了研究依据[14]。利用代谢组学技术对尿液进行监测，可以较为准确地把握神经系统中组织或细胞的代谢异常，为这类疾病的诊断、病理机制研究及治疗带来全面的信息和希望。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。