载脱钙骨基质的3D打印多孔生物陶瓷的制备及其成骨性能研究*

张铁 胡丽 蔡志祥 杜小青 闫飞飞 王志勇 张旗* 蔡林

3D 打印作为新兴的材料制造技术，由于其独特的成型优势，在医疗行业有着不可替代的地位[1-2]。其中，选择性激光烧结（selective laser sintering，SLS）技术已经运用在金属医疗器械的制造成型上，显示出较传统工艺更为满意的结果[1-2]。常用的3D打印技术还有熔融沉积成型（fused deposition modeling，FDM）和立体光刻（stereolithography，SLA）技术，其中SLA 具有更高的精度，能够完成更为复杂的模型打印[3-6]。

传统的生物陶瓷材料的主要成分为磷酸钙和羟基磷灰石，该类陶瓷具有较好的生物相容性和力学性能，但是降解性能差，植入体内后难以降解，阻碍新骨的形成[7-11]。但是通过3D 打印技术可以实现材料复杂的多孔结构，有利于骨组织的长入，同时多孔结构会增加材料的比表面积，能够加速其降解，进而可以解决其降解能力差的缺点[1-2,4]。

硫酸钙具有良好的降解能力和生物相容性，在临床上具有广泛的应用[11-13]。但是在烧结过程中由于有机成分的存在，会降低其分解温度，导致成型困难，故而难以应用到SLA 技术中制备多孔生物陶瓷。同种异体骨，如脱钙骨基质（decalcified bone matrix，DBM），其天然微孔结构有利于传导成骨，同时富含骨形态发生蛋白等生长因子而具有诱导成骨能力，在临床上显示了良好的成骨能力[11,14-17]。为了保持其诱导能力，DBM 在加工过程中不能进行高温处理。

1 材料与方法

1.1 3D 打印多孔生物陶瓷的制备

将二水磷酸氢钙（医药级，洛阳龙门药业有限公司）、碳酸钙（医药级，上海碳酸钙厂）按照摩尔比2∶1 添加到球磨罐中，添加无水乙醇（医药级，新乡市先丰医药新材料有限公司）和磨球，球磨2～5 h，在干燥箱中干燥至恒重后转移到马弗炉中高温煅烧，冷却后球磨，得到-磷酸三钙粉料。

选用200～300 g 雄性SD 大鼠50 只[湖北省实验动物研究中心提供，动物使用许可证号：SCXK（鄂）2008-0004]，麻醉处死后取长管骨段压碎后用手工磨粉器将其制作成骨粉，用分析筛筛选100～900m 的骨粉备用。10℃～12℃条件下，用乙醇复合溶剂进行脱脂，磁力搅拌24 h，用纯化水进行反复震荡冲洗40 min。用0.6 mol/L 的盐酸对骨粉进行脱钙，磁力搅拌器持续搅拌24 h，更换盐酸溶液后又脱钙24 h。用纯化水反复冲洗骨粉1 h。将所有骨粉同时进行冷冻干燥24 h。

将DBM 添加到2%的羟丙甲纤维素（医药级，浙江中维药业股份有限公司）溶液中，搅拌混合均匀，然后注射到3D 打印多孔生物陶瓷的孔道中，冷冻干燥，得到载DBM的多孔生物陶瓷。

1.2 3D 打印多孔生物陶瓷理化性能研究

1.2.1 -磷酸三钙理化性能表征

使用德国布鲁克AXS 公司D8 Advance 型X 射线衍射分析仪对合成的-磷酸三钙粉料的物相结构进行分析表征。XRD 分析条件：靶：Cu-Ka 射线（=0.154 06 nm），管压：40 kV，管流：40 mA，2扫描范围：10°～80°。

采用英国马尔文仪器公司MS2000 型激光粒度分布仪进行粒径分析。

1.2.2 3D 打印多孔生物陶瓷理化性能表征

利用美国Instron 公司万能材料试验机Instron 5967 测量抗压强度，探头加载速度为0.5 mm/min。

使用德国蔡司Zeiss Ultra Plus 型场发射扫描电子显微镜（FE-SEM，放大倍数：12～1 000 000）对粉体和陶瓷微观形貌进行观察，同时自带配套能谱仪（EDS），用于分析测试样品的元素组成。

按《中华人民共和国药典》（第四部）中0821 重金属检查法进行检测样品的重金属总量。

1.3 细胞毒性

将细胞浓度为1.0×105个/mL 的细胞（L929）悬液按100L/孔接种于96 孔板，置于37℃、5%CO2、饱和湿度的细胞培养箱中培养24h。去除原培养液，用PBS 清洗3 遍，按照100L/孔分别加不同浓度的材料浸提液（浸提条件为：按照0.2 g/mL，在37℃下浸提24 h）与对照溶液，空白对照为MEM 培养液，阴性对照为含10%生理盐水的MEM 培养液，阳性对照为含10%DMSO 的MEM 的培养液，每组设置6 个复孔，继续培养，分别于24 h、72 h 时观察细胞生长状态。

1.4 动物试验

1.4.1 动物模型的制作与分组

3D 打印多孔生物陶瓷和载DBM 的3D 打印多孔生物陶瓷经钴60 灭菌（16～25 kGy）后备用。

健康8 周雄性SD 大鼠12 只（湖北省实验动物研究中心提供），体量160～200 g。采用异氟烷进行呼吸麻醉，大鼠头部剃毛后常规消毒铺巾，在无菌条件下切开皮肤，切口长约1.5 cm，使用磨骨钻造孔（6 mm），植入样本材料，缝合筋膜皮肤，放回笼内分开养殖，动物苏醒后自由活动，正常喂食。手术后8 周处死动物，取植入物及其周围的骨组织。3D-TCP 组：植入3D 打印多孔生物陶瓷，每组4 只；3D-TCP/DBM 组：植入载DBM 的3D 打印多孔生物陶瓷，每组4 只；空白组：不植入任何材料，每组4 只。

1.4.2 组织形态学观察

标本经10%福尔马林固定后，常规脱钙、脱水、透明、石蜡包埋、切片，常规行HE 和Masson 染色，观察组织学变化。

1.5 统计学方法

采用SPSS 16.0 统计学软件处理数据，数据以均数±标准差表示，采用检验，<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

图1 -磷酸三钙的粒径分布

图2 -磷酸三钙的XRD 图谱

2.2 3D 打印多孔生物陶瓷理化性能

在1 050℃、1 150℃、1 250℃和1 350℃条件下烧结的样品的重金属总量均<50 ppm。

3D 打印多孔生物陶瓷在1 050℃、1 150℃、1 250℃和1 350℃条件下烧结的样品的抗压强度分别为（8.57±2.10）MPa，（17.02±5.16）MPa，（19.35±2.94）MPa，（15.9±3.45）MPa，其中在1 250℃条件下烧结的样品抗压强度最高，在1 150℃、1 250℃和1 350℃条件下烧结的样品与在1 050℃条件下烧结的样品的抗压强度比较，差异具有统计学意义（见图3，<0.05）。

图3 3D 打印多孔生物陶瓷在不同烧结温度下的抗压强度（*<0.05，**<0.01，***<0.001；n=6）

图4 为3D打印多孔生物陶瓷在不同烧结温度下的SEM图和EDS 图，从图4 中可以看出，在1 050℃条件下烧结，微观结构为明显的颗粒状；在1 150℃条件下烧结，-磷酸三钙颗粒连接为整体，存在一定的孔隙；在1 250℃条件下烧结，-磷酸三钙连接为致密的整体，存在少量的空隙；在1 350℃条件下烧结，材料烧结为整体，但是可以看到颗粒之间存在明显的界限，且孔隙较1 250℃条件下增多。所有条件下烧结的样品表面均可观察到分布均匀的Ca 和P，表观Ca/P 为1.52±0.06。

图4 3D 打印多孔生物陶瓷在不同烧结温度下的SEM 图（×5000）和EDS 图

2.3 细胞毒性

培养24 h，空白组、3D-TCP 组和3D-TCP/DBM 组的OD 值分别为0.79、0.69 和0.70，得到3D-TCP 组和3D-TCP/DBM 组的存活率分别为87.3%和88.6%，大于GB/T 16886.5要求的70%，无细胞毒性；培养72 h，空白组、3D-TCP 组和3D-TCP/DBM 组的OD 值分别为1.48、1.11 和1.19，得到3D-TCP 组和3D-TCP/DBM 组的存活率分别为75.0%和80.4%，无细胞毒性。

图5 3D 打印多孔生物陶瓷体的外细胞毒性评价

2.4 植入试验

2.4.1 大体观察

SD 大鼠均无死亡，活动、进食情况正常，精神状态无明显变化。未见瘫痪、惊厥、呼吸抑制等不良反应。伤口均愈合良好。空白组骨缺损区域未见明显减小，无明显成骨（见图6A1 和6A2）。3D-TCP 组：取材后，3D 打印多孔生物陶瓷与周围骨组织融合，可见组织长入孔隙，未见材料明显降解，形态未发生明显改变（见图6B1 和6B2）。3D-TCP/DBM 组：取材后，可诱导3D 打印多孔生物陶瓷与周围骨组织融合，可见组织长入孔隙，中间孔隙DBM 形态发生改变，转化为较硬的骨组织，并与-磷酸三钙支架融合，未见支架明显降解（见图6C1 和6C2）。

图6 3D 打印多孔生物陶瓷外观形态：A1、A2.空白组0 周和8 周时形态；B1、B2.3D-TCP 组0 周和8 周时形态；C1、C2.3D-TCP/DBM 组0 周和8 周时形态

2.4.2 组织形态学观察

图7 为大鼠颅骨植入试验8 周后取材HE 和Masson 染色结果。空白组骨缺损界限清晰，无明显骨组织生长，在骨缺损处可见少量新生血管（见图7A 和图7D）。3D-TCP 组可见大量-磷酸三钙材料残留，同时也能观察到材料少量降解，在降解空隙中可见少量组织长入；同时可以观察到，在材料孔隙中有大量的新生血管和骨组织生成，新生骨组织与3D打印多孔生物陶瓷紧密结合，沿着孔隙向内生长（见图7B和图7E）。3D-TCP/DBM 组中同样可见大量-磷酸三钙材料残留和少量材料降解，其中DBM 基本转化为新生骨组织，可见大量骨细胞和骨髓生成，且融合为整体；DBM 转化生成的新生骨组织占据整个中间孔隙，且向周围孔隙生长，同时在周围孔隙可见大量新生血管，骨组织生长于多孔生物陶瓷的孔隙中，且与多孔生物陶瓷紧密接触（见图7C和图7F）。

图7 SD 大鼠颅骨植入试验的HE 和Masson 染色切片（术后8 周）：A-C.空白组、3D-TCP 组和3D-TCP/DBM 组HE 染色；D-F.空白组、3D-TCP组和3D-TCP/DBM 组Masson 染色

3 讨论

采用SLA 技术进行3D 打印的优点主要在于可实现规模化生产，产品精度高，能够设计复杂的内部孔隙和外部结构，可进行个性化定制，从而可以减轻患者痛苦，同时增加产品成骨能力[1-2]。而这些优点都是建立在打印的粉料具有良好的生物相容性、足够小的粒径（<10m）和良好的热稳定性的基础上[2,4,6]。相比较羟基磷灰石，采用-磷酸三钙作为打印粉料，主要是因为其具有良好的降解性能[9-11]。同时本文合成的-磷酸三钙具有较高的纯度，XRD 图谱未观察到任何杂质峰，确保其良好的生物安全性，且粒径小于10m，分布范围窄，确保其打印精度，为个性化定制奠定基础。从制备的植入材料外形可以看出，样品具有均匀的孔隙结构，孔径为0.5mm，外观规整。

孔径和孔连通率是影响骨传导性能的关键因素，支架孔径为300～500m 时，且具备高孔连通率时，有助于骨和血管的长入，具备良好的骨传导作用，促进成骨[18-19]。3D 打印多孔生物陶瓷为孔隙完全连通的多孔结构，多孔结构会增加材料比表面积，同时材料由外到内整体与体液接触，在一定程度上会加快材料的降解速度；磷酸钙降解过程中会释放钙离子和磷酸根离子，有助于类骨质的钙化，形成新骨[10]。负载DBM 时，由于其特殊的结构，使得DBM 充分暴露在体液环境中，有助于DBM 的分解，同时DBM 具备骨诱导能力，降解过程中会释放BMP 等生长因子，自身逐渐被新骨替代，加之支架的骨传导作用，内外同时传导，加速骨愈合[13-15]。术后8 周，可以看到空白组无明显骨组织生长，而3D-TCP 组有大量新骨和血管长入，血管的长入为新骨的生长提供了营养基础，且骨组织与材料结合紧密，体现了良好的骨传导作用；3D-TCP/DBM 组中DBM 在没有与骨组织接触的情况下转化为新骨，且新骨内可见骨髓，体现DBM 具备骨诱导能力，并可见新骨向孔隙结构中传导的趋势，实现了内外共同传导的目的；大部分-磷酸三钙支架没有降解，在前期支架可以起到骨传导和提供钙离子和磷酸根离子的作用，最后会被完全吸收，转化为新骨。通过3D 打印多孔生物陶瓷和DBM的协同作用，达到前期快速成骨的目的，进一步加快了骨愈合。

本研究制备的3D打印多孔生物陶瓷具有良好的生物相容性和骨传导性，在1 250℃条件下烧结力学性能更优，结构更为致密，该多孔结构有助于骨和血管的长入，实现材料的骨传导作用；通过负载DBM，可实现骨的双向传导，加速骨愈合。有待通过研究更多动物模型来进一步研究3D 打印多孔生物陶瓷的骨传导和骨诱导性能。