响应面优化油茶籽油游离型特征酚和总酚工艺

魏 征 杨剀舟 栾 霞 李秀娟 段章群 郭咪咪 杨 茜

(国家粮食和物资储备局科学研究院粮油加工研究所，北京 100037)

油茶(CamelliaoleiferaAbel)，山茶科、山茶属的常绿灌木或小乔木[1，2]，种植面积和产量位于我国木本油料之首[3]。油茶籽油源于油茶籽，富含油酸和亚油酸等不饱和脂肪酸[4]，还含有多酚、生育酚、角鲨烯、植物甾醇和类胡萝卜素等功能营养伴随物[5，6]，具有抗癌、抗炎、抑菌、防氧化等保健功效[7-10]。因此，油茶籽油又被称为“东方橄榄油”，是提供优质、健康植物油的重要来源。

国内外研究发现，茶油的保健功效与其含有的天然抗氧化成分多酚密不可分[11，12]。但这些多酚的种类、含量和性质，受原料来源、预处理、加工工艺，提取和测定方法等多种因素的共同影响[13-15]。油脂多酚提取常采用溶剂浸提法，使用甲醇、乙醇和正己烷等溶剂，但传统萃取有较多缺点，需辅助超声、微波和负压空化法等，提高萃取效率并降低能耗[16，17]。植物多酚常以游离型和结合型存在，由于检测条件的限制，目前油脂多酚评价主要针对总酚含量，多酚鉴定研究也多停留在游离酚层面，降低了其实际应用价值[18，19]，现有的“极性悖论”及“胶体缔合”假说[20]亦未能有效阐明油脂中不同形态多酚的抗氧化机制。因此，茶油多酚形态研究尚处于起步阶段，酚类化合物形态分布的意义亟待揭示。油茶籽油中不同形态多酚组成不同，有必要基于总酚含量结合特征酚(如羟基肉桂酸和羟基苯乙酸等)，对油茶籽油中不同形态多酚提取工艺进行系统研究和优化。

本研究针对冷榨油茶籽油中以反-肉桂酸和4-羟基苯乙酸为主的游离型特征酚和总酚提取工艺进行优化，旨在完善游离型多酚提取方法，为后期油茶籽油不同形态多酚提取、鉴定与评价，油茶籽油适度加工过程多酚保留及调控提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

普通油茶籽品种，2018年购于湖南衡阳。乙腈、甲醇、甲酸、反-肉桂酸和4-羟基苯乙酸等，均为色谱纯；甲醇、乙醇、正己烷和Na2CO3等，均为分析纯。

1.2 仪器与设备

Q-TOF 6545型超高效液相色谱-四级杆-飞行时间-质谱联用仪(UPLC Q-TOF MS，搭配UPLC 1290 Infinity II液相系统、Dual AJS离子源和质谱自动校准系统)，Syenrgy H1MFD型酶标仪，FW-135型中草药粉碎机，ENG2-A型液压榨油机，SI-T236型Vortex-Genie2旋涡混合仪，KQ-300V DV型三频数控超声波清洗器，SHP DC-1015型低温恒温槽，Sigma 3-18K型高速冷冻离心机，BUCHI R-215型旋转蒸发仪。

1.3 方法

1.3.1 样品前处理

采购后的油茶籽原料，经低温干燥至含水量5%～7%，4 ℃冷藏暂存。使用时经壳仁分离、粉碎过筛，混合制胚(含壳率15%)，冷榨以获得初榨油，离心过滤，充氮避光4 ℃保存。

1.3.2 超声波辅助溶剂法提取油茶籽油游离型多酚

参考实验室已有方法[14,21]和Alu′Datt等[22]的方法，略作改动。准确称取1.000 0 g油茶籽油于50 mL离心管中，按料液比1∶1和1∶20(g/mL)加入正己烷和甲醇，分别漩涡30 s，置于超声波清洗器中(通过玻璃反应釜和低温恒温槽实现提取过程动态精准控温)，在30 ℃、270 W、45 kHz下超声提取30 min，7 600 g离心10 min，分离有机相，残油重复提取2 次。合并3次有机相，40℃下真空旋蒸，2 mL色谱纯甲醇复溶，-20 ℃保存。样品先经0.22 μm有机膜过滤，再上UPLC Q-TOF MS检测。

1.3.3 油茶籽油游离型多酚提取单因素实验

对溶剂比例、料液比、超声功率、提取时间、提取温度和提取次数等进行单因素实验，以确定各因素影响程度和适宜范围。单因素实验参照1.3.2，只变更单因素项，其余不变。其中，甲醇比例选用50%～100%，料液比选用1∶5～1∶30，超声功率选用150～300 W，提取时间选用10～60 min，提取温度选用20～70 ℃，提取次数选用1～6次。

1.3.4 响应面优化油茶籽油游离型多酚提取工艺

根据单因素实验结果，以游离型反-肉桂酸、4-羟基苯乙酸和总酚含量为响应值，应用Box-Behnken实验设计，对料液比、超声功率和提取时间3个因素进行响应面分析。各因素及水平编码见表1。

表1 油茶籽油游离型多酚提取因素水平表

1.3.5 指标测定1.3.5.1 总酚含量测定

参考实验室已有方法[14,23]，略作改动。取20 μL样液或各梯度标准液至2 mL离心管，依次加入780 μL蒸馏水、50 mL福林酚试剂和150 μL质量分数20%的Na2CO3溶液。漩涡30 s，40 ℃水浴30 min，使用酶标仪在760 nm波长处测定吸光度。结果以没食子酸当量表示(mg/kg)，标准曲线y=0.001 2x+0.000 7(R2=0.999 8)，线性范围0～500 μg/mL。

1.3.5.2 游离型特征酚含量测定

UPLC Q-TOF MS分析参考实验室已有方法[14,23-24]，有改动。

色谱条件：Agilent UPLC 1290液相系统，Poroshell 120 EC-C18柱(2.1 mm×100 mm×2.7 μm)；流动相A为0.1%甲酸-水，流动相B为0.1%甲酸-乙腈。洗脱梯度：0～2 min，5% B；2～20 min，5%～45% B；20～21 min，45%～95% B；21.1～32 min，柱子冲洗平衡。流速300 μL/min，柱温35 ℃，进样量5 μL。

质谱条件：Agilent Q TOF 6545质谱系统，ESI负离子全扫描模式。离子源干燥气温度350 ℃，干燥气流速10 L/min，雾化气压力40 psi，鞘气温度400 ℃，鞘气流速12 L/min，毛细管裂解电压-3.5 kV，毛细管出口电压135 V，碰撞能量(30±5) eV，扫描范围100～1 000 u。反-肉桂酸标准曲线y=62 154.34x+12 712.82(R2=0.999 9)，线性范围0～5.47 μg/mL；4-羟基苯乙酸标准曲线为y=51 854.60x+1 264.02(R2=0.999 6)，线性范围为0～5.52 μg/mL。

1.4 数据处理

实验平行3次，结果以平均值±标准偏差表示。采用Microsoft Excel 2016统计所有数据，Origin 2020作图，SPSS 26.0进行差异显著性分析(Duncan′s，P=0.05)，Design-Expert 12.0进行响应面分析。

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果

2.1.1 甲醇比例对油茶籽油游离型多酚含量的影响

图1表明，油茶籽油中游离型总酚和特征酚在

注：不同小写字母代表0.05水平上存在显著性差异。下同。图1 甲醇比例对油茶籽油游离型多酚含量的影响

甲醇比例较低时含量较低，相互间差异不显著，80%以后快速升高，100%时达到最高，如100%甲醇时的总酚、反-肉桂酸和4-羟基苯乙酸含量分别是50%时的4.11、2.04和1.86倍。表明油茶籽油游离型多酚含量与甲醇浓度显著正相关，与魏征等[21]及周晴芬[25]所发现的丙酮和乙醇等有机溶剂浓度越高，对多酚的提取效果越好相一致。因此，后续选择100%甲醇进行实验。

2.1.2 料液比对油茶籽油游离型多酚含量的影响

由图2可知，料液比显著影响油茶籽油中游离型多酚含量。在料液比1∶5～1∶20范围内，多酚含量均随着提取溶剂用量增大而增大，随后显著下降至最低，如在料液比1∶20时总酚和反-肉桂酸含量分别达到110.11 mg/kg和571.48 μg/kg，而在1∶30时其含量分别仅为前者的67.79%和75.55%。综合认为，选择料液比1∶20效果最好。

图2 料液比对油茶籽油游离型多酚含量的影响

2.1.3 超声功率对油茶籽油游离型多酚含量的影响

图3反映了不同超声功率下油茶籽油中游离型多酚含量变化。当超声功率在150～210 W时，总酚和反-肉桂酸含量无显著性差异，在240 W时有显著最高值，后又快速下降。而4-羟基苯乙酸含量不受超声功率的显著影响，但变化趋势与总酚相一致，从而选择240 W进行后续研究。超声功率对游离型总酚和特征酚含量影响趋势不同，主要是超声强度影响介质中的空化作用强度，在最合适的超声功率下，空化作用与机械作用有最佳结合点，此时有效成分溶出最完全，提取率最大[26]，但对不同有效成分影响有一定差异。

图3 超声功率对油茶籽油游离型多酚含量的影响

2.1.4 提取温度对油茶籽油游离型多酚含量的影响

提取温度对油茶籽油游离型多酚含量有较大影响(图4)，其总酚和特征酚均在20 ℃提取时较低，30℃提取时最高，随后在30～70 ℃提取时又显著下降，只有少量例外。其中，反-肉桂酸的下降趋势最为明显，从20 ℃提取时的600.51 μg/kg下降到70 ℃提取时的339.20 μg/kg，减少了43.51%，表明30 ℃后，油茶籽油游离型多酚与提取温度显著负相关，且反-肉桂酸更具有温度敏感性。

图4 提取温度对油茶籽油游离型多酚含量的影响

2.1.5 提取时间对油茶籽油游离型多酚含量的影响

图5表明，油茶籽油中游离型总酚和特征酚含量均在10～30 min内随提取时间延长逐渐增大，30 min后总酚和4-羟基苯乙酸略有上升，但相互之间无显著性差异，而反-肉桂酸则显著下降。一般提取时间越长多酚含量越高，但大于30 min后特征酚含量反而降低，可能是某些脂溶性成分随提取时间延长而溶出[21]，因此后续选择30 min继续研究。

图5 提取时间对油茶籽油游离型多酚含量的影响

2.1.6 提取次数对油茶籽油游离型多酚含量的影响

图6表明，油茶籽油中游离型4-羟基苯乙酸和反-肉桂酸分别在提取2和3次时含量最高，随后略有下降；而总酚则随提取次数增加逐渐增加，但在提取3次后无显著性差异。同时发现，提取次数与料液比存在交互作用，通常料液比越大，提取效果越好，所需提取次数越少，与前人研究结果相似[27，28]。但提取次数过多会造成溶剂和能源浪费，也给蒸发、浓缩等后续处理带来麻烦，因此选择3次开展实验。

图6 提取次数对油茶籽油游离型多酚含量的影响

2.2 响应面优化结果

2.2.1 回归方程的建立与方差分析

根据表2实验结果，进行回归分析(表3)，拟合后得到超声波辅助溶剂提取油茶籽油中游离型多酚的二次多项回归方程：Y总酚= 98.84-4.50A-3.35B+2.45C+2.32AB-4.71AC+3.19BC-14.40A2-17.13B2-14.85C2；Y反-肉桂酸=516.62-14.80A-26.02B+9.54C-31.22AB-27.00AC-25.04BC-23.58A2-58.94B2-46.83C2；Y4-羟基苯乙酸=346.81+14.39A-2.10B+14.53C+9.24AB-6.54AC-8.43BC-28.64A2-21.12B2-21.05C2。

表2 响应面实验设计及结果

表3 回归方程各项方差分析

2.2.2 响应面分析

考虑到响应面模型中反-肉桂酸含量的拟合度不好，此处仅分析各因素交互作用对总酚和4-羟基苯乙酸含量的影响。其中，料液比和提取时间交互作用对游离型总酚含量影响显著，但各因素交互作用对游离型4-羟基苯乙酸含量影响不显著，与方差分析相一致。

2.2.3 验证实验

根据建立的模型进行参数最优化分析，得到的最佳工艺条件为：料液比1∶19.73(g/mL)、超声功率265.77 W、提取时间31.86 min，此时游离型总酚、反-肉桂酸和4-羟基苯乙酸的含量分别为99.10mg/kg、520.70 μg/kg和348.14 μg/kg。为了便于实际操作，确定油茶籽油游离型多酚提取条件为：料液比1∶20、超声功率270 W、提取时间32 min，进行3 组平行验证实验，得到游离型总酚、反-肉桂酸和4-羟基苯乙酸含量分别为(104.86±8.47) mg/kg、(506.21±25.62) μg/kg和(340.18±18.33) μg/kg，变化幅度在-2.28%～+5.81%之间，实际结果与理论预测吻合度较高，得到的最佳提取条件可靠且有应用价值。

3 结论

本研究采用超声波辅助溶剂提取法，针对冷榨油茶籽油中以反-肉桂酸和4-羟基苯乙酸为主的游离型特征酚和总酚提取工艺进行优化。根据单因素实验结果，选择料液比、超声功率和提取时间3个因素进行响应面分析，得到的最佳工艺条件为：料液比1∶19.73(g/mL)、超声功率265.77 W、提取时间31.86 min。在优化条件下进行验证实验，其游离型总酚、反-肉桂酸和4-羟基苯乙酸含量分别为(104.86±8.47) mg/kg、(506.21±25.62) μg/kg和(340.18±18.33) μg/kg。所评价的实验因素和所优化的实验参数准确可靠，所确定的各因素较优水平范围真实有效，可用于实际提取操作。本研究旨在完善油茶籽油游离型多酚提取方法，可为后期油茶籽油结合型多酚提取与鉴定，油茶籽油适度加工过程多酚保留与调控提供理论依据。