诱变筛选高产虾青素法夫酵母及发酵条件优化
2021-12-21刘晓桐，孙欣宇，刘玥，王一惠，刘冰南
刘 晓 桐，孙 欣 宇，刘 玥，王 一 惠，刘 冰 南
(大连工业大学 生物工程学院,辽宁 大连 116034 )
0 引 言
虾青素是一种类胡萝卜素，具有很强的抗氧化性能[1-3]。与化学合成的虾青素相比，天然虾青素更加安全、易利用[4-6]。法夫酵母作为目前最主要的天然虾青素来源之一，具有发酵条件简单、易于高密度培养、生长周期较短等特点[7-9]。野生型红法夫酵母含30～100 μg/g的类胡萝卜素，其中90%为虾青素，但虾青素的总产量低，同时菌种的发酵温度较低(20 ℃)等因素限制了其工业生产的可能性[10-12]。王立梅等[13]采用析因设计法、中心组合设计及响应面分析法使得虾青素产量从5.89 μg/mL提高到10.9 μg/mL。郑蕾等[14]研究发现蔗糖和葡萄糖分别是红法夫酵母生长和积累虾青素的最佳碳源；在最佳氮源组成的情况下，虾青素的产量达到6.78 mg/L。因此，提高法夫酵母的发酵温度和虾青素的产量、降低成本成为当前的研究热点。
本试验以在25 ℃下可以生长且产虾青素的突变菌株XD-YB作为出发菌株，使用亚硝基胍(NTG)作为诱变剂，对法夫酵母进行诱变[15]。后使用二苯胺(DPA)作为筛选剂，筛选出一株性状稳定、高产虾青素的突变菌株——法夫酵母X-NTG-25。为确定最佳发酵工艺条件，以虾青素为指标，采用响应面法对培养基和培养条件进行优化[16]，以期得到虾青素产量的最优培养基成分和条件。
1 材料与方法
1.1 材 料
菌株：红法夫酵母(XD-YB)，实验室前期诱变获得的耐热菌株。
培养基：PDA培养基
1.2 方 法
挑取斜面上的菌株至装有50 mL新鲜PDA培养基的250 mL锥形瓶，置于25 ℃、180 r/min的恒温摇床，培养36～48 h至对数生长期。
1.2.1 虾青素质量分数的测定
采用冰冻-酸-热法[17]提取虾青素。试验重复3次，直至菌体颜色变白，上清液过滤膜待测。
采用高效液相色谱法测定虾青素含量[18]。色谱柱：C18色谱柱(250 mm×4.6 nm×5 μm)；检测器，紫外UV检测器；检测波长，478 nm；进样量，20 μL；体积流量，1 mL/min；柱温为室温。
流动相A，90%甲醇；流动相B，10%乙腈。
洗脱条件：90% A和10%B，0 min；50% A和50% B，20 min；100% A，71 min。
采用直接干燥法测定菌体的生物量[198]。
1.2.2 诱变方法
采用20 μg/mL亚硝基胍对红法夫酵母诱变处理20 min，仅5%～10%细胞存活，用0.1 mol/L pH 7.0柠檬酸缓冲液洗涤，于PDA培养基中培养6 h，再涂布于含有40 μmol/L二苯胺的PDA固体平板上，25 ℃培养。待平板上长出红色菌落，即为二苯胺抗性菌落。
1.2.3 响应面法优化法夫酵母的发酵条件
1.2.3.1 Plackett-Burman试验设计
根据单因素试验结果，采用用PB试验，有效地将关键因素挑出来。选择发酵条件中的6个因素作为考察对象，试验次数N=12，高水平和低水平因子分别编码为“1”和“-1”进行试验。
1.2.3.2 中心组合设计
根据PB试验得出的关键因素作为响应面的3个因素。采用Design-Expert软件中的CCD组合设计法确定发酵条件的试验方案。以各试验单因素最优取值点为中心，上下区域各取1个水平值作为响应面试验设计水平。因子分别编码为-1.682、-1、0、1和1.682，中心点试验次数为20。根据相应的CCD试验方案进行试验后，对试验数据进行二次回归模型的拟合，得到合适的回归方程[20]。
2 结果与讨论
2.1 诱变筛选二苯胺抗性菌株
二苯胺是酵母类胡萝卜素合成抑制剂，会使红酵母丧失合成色素的能力而使菌落呈现淡黄色或者白色，因此可以筛选出高产虾青素的法夫酵母菌株[21]。在诱变培养基上挑选出变红的抗性菌落至液体摇瓶进行摇瓶发酵。经筛选，虾青素质量分数超过200 μg/g的菌株有3株。
2.2 遗传稳定性验证
3株菌经连续传代5次，检测菌株每一代的虾青素产量。结果发现，1号和2号诱变株都出现了产量不稳定的现象，虾青素产量下降率较大，而菌株X-NTG-25产量稳定，结果如表1所示。从表中可以看出，菌株X-NTG-25的每一代产量变化不超过6%，表明这株诱变菌株的虾青素产量相对稳定，且虾青素产量达到213.94 μg/g，较出发菌株的虾青素产量提高了52%。
表1 突变菌株的稳定性鉴定Tab.1 Stability identification of mutant strains
2.3 Plackett-Burman设计
研究了6种发酵条件对法夫酵母中虾青素积累的影响，这6种条件都是在单因素试验中对虾青素产量有显著影响的因素，设计及结果见表2。
表2 Plackett-Burman试验设计与结果Tab.2 Design and results of Plackett-Burman
对回归方程进行方差分析，揭示因子和响应值的关系，结果如表3所示。从表3可以看出，自变量和因变量具有显著相关性(P=0.024 7<0.05)，表明线性回归方程是拟合的。X1，X4，X5的P<0.05，表明Fe2+浓度、温度和转速的效果显著。
表3 各因素水平及显著性分析效应值Tab.3 Prominent analysis of factor levels and effect value
2.4 虾青素产量的响应面分析与优化
2.4.1 回归模型的建立及显著性检验
以Fe2+浓度、转速和温度3个因子作为考察对象，通过中心组合试验设计了三因素五水平的试验，记录每组因素组合的试验结果，并将试验结果填入对应列，结果见表4。
表4 中心组合试验设计及结果Tab.4 Design and results of central composed experiments
采用Design-Expert软件进行多元回归拟合，得到以虾青素为目标函数的二次回归方程：
Y=268.46-16.80A-19.16B+1.9C+
16.52AB-4.31AC+7.81BC-
36.44A2-43.71B2-35.55C2+
32.04A2B+42.69AB2+26.19A2B2
2.4.2 响应面分析
根据回归方程预测不同条件对法夫酵母产虾青素产量的影响，结果如图1所示。由图1可以看出，模型响应值最大时的最佳条件为转速195.59 r/min、温度21.99 ℃、Fe2+浓度1.51 μmol/L。考虑到实际操作因素，确定法夫酵母的发酵条件为转速195 r/min、温度22 ℃、Fe2+浓度1.51 μmol/L。
2.4.3 法夫酵母发酵最佳条件的确定和验证
为了确定模型的准确性(回归方程)并验证优化结果，在最佳的培养条件下重复试验3次。得到法夫酵母虾青素产量的预测值和试验值分别为272.58和(279.89±9.53)μg/g，误差仅为2.7%。虾青素实际产量与模型预测值非常契合，比初始条件下的产量提高了30.8%。与已有研究结果相比，本结果在虾青素研究中属于中等水平[4-5]，但能在25 ℃下进行发酵，为后续试验提供一个出发菌株。
(a)转速和Fe2+浓度
3 结 论
通过化学诱变法得到了遗传稳定且高产的法夫酵母突变株X-NTG-25。采用PB设计分析了转速、温度、接种量、Fe2+浓度、K+浓度和葡萄糖质量浓度6种因素对法夫酵母虾青素产量的影响，筛选出3个影响显著因子。中心组合设计和响应面分析结果表明，转速、温度和Fe2+浓度三因素对虾青素产量影响最大。优化得到的法夫酵母X-NTG-25发酵最佳条件为转速195 r/min、温度22 ℃、Fe2+浓度1.5 μmol/L。在最佳条件下，虾青素产量为279.89 μg/g，与出发菌株相比提高了98.9%。
