益气活血方及其拆方对出血性血小板病患者静脉血iRhom2及GPⅤ表达的影响*

马 陈 廖 奕 沈 霖 卢芙蓉 帅 波

华中科技大学同济医学院附属协和医院中西医结合科，武汉 430022

益气活血方是沈霖教授治疗出血性血小板病的经验方，经20余年临床验证，该方在控制临床出血症状、纠正血小板聚集缺陷及降低停药1年后复发率等方面均明显优于常规西药肾上腺色腙片[1]。近期临床药物试验[2-3]提示，调控非活性的菱形蛋白2(inactive rhomboid-like protein 2，iRhom2)及血小板膜糖蛋白Ⅴ(platelet membrane glycoprotein V，GP Ⅴ)的表达可能是益气活血方治疗出血性血小板病作用靶点之一。为了进一步研究益气活血方组方药物的具体作用靶点以及作用机制，本研究通过人血标本体外加药的方法，观察了全方、配伍组和单味药组对出血性血小板病患者静脉血中iRhom2及GP Ⅴ表达的影响，旨在探讨益气活血方治疗出血性血小板病的作用机制及益气活血中药配伍的影响。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2020年10月—2021年3月就诊于本院中西医结合科门诊的33例出血性血小板病患者作为研究组，其中男9例，女24例；年龄(34.51±14.27)岁，年龄范围为20～57岁；病程(7.18±5.26)年，病程范围为2～13年。另选30例血小板聚集检测无异常发现的健康献血员作为正常对照组，其中男10例，女20例；年龄(33.27±8.26)岁，年龄范围为21～55岁。2组患者性别、年龄比较，差异无统计学意义(P<0.05)。

1.2 诊断标准

研究组患者符合文献[4]中出血性血小板病相关的诊断标准：患者有多部位出血临床表现；按常规操作检测患者血小板聚集最大聚集率，其中最大聚集率在21%～40%者为反应不良，低于20%者为反应缺如，患者对1项或多项诱聚剂诱导的聚集反应不良或缺如。

1.3 纳入及排除标准

纳入标准：符合上述诊断标准；在本研究前2周内，未服用阿司匹林、潘生丁、肝素以及活血化瘀类中药等可能影响血小板功能的药物；同意参与本项研究并签署知情同意书。

排除标准：经内科、血管外科、耳鼻喉科、妇科、口腔科和眼科等科室诊视，发现诊断性出血病灶；合并其他脏器重大疾病且预后不佳者；精神类疾病或智力、语言障碍者；不愿意签署知情同意书者。

1.4 体外干预方法

1.4.1 血液标本的制备 采用真空采血管(美国BD公司)采集所有受试对象清晨空腹肘静脉血，以3.8%枸橼酸钠进行抗凝处理，血液与抗凝剂的比例为9：1。出血性血小板病患者静脉血经抗凝处理后分为12等份，每份0.75 mL血液标本；健康献血员静脉血经抗凝处理后取1份0.75 mL血液标本。

1.4.2 中药拆方及分组 ①全方组：黄芪10 g、党参10 g、当归10 g、白芍5 g、桃仁5 g、甘草2 g；②益气活血组(全方去甘草)：黄芪10 g、党参10 g、当归10 g、白芍5 g、桃仁5 g；③黄芪当归组：黄芪10 g、当归10 g；④益气组：黄芪10 g、党参10 g；⑤活血组：当归10 g、白芍5 g、桃仁5 g；⑥黄芪组：黄芪10 g；⑦党参组：党参10 g；⑧当归组：当归10 g；⑨白芍组：白芍5 g；⑩桃仁组：桃仁5 g；甘草组：甘草2 g。中药饮片均由本院中药房提供。

1.4.3 药物的制备 参照文献[5]，中药用200 mL清水浸泡12 h，武火煮沸，文火煮0.5 h；取出药液后，再加入200 mL清水，武火煮沸，文火煮0.5 h，取药液；将2次药液合并，浓缩至较高浓度。按体积比2：3加入无水乙醇，4 ℃静置24 h，用无菌滤纸滤去残渣；再用旋转蒸发仪蒸发至无醇味，并进一步将各组药液浓缩至10 mL，调整pH值为6.8～8.5，均匀倒入培养皿置于-20 ℃预冻；然后冷冻真空干燥，得到粉末状物质，放入干燥器中备用。根据既往体外实验[6-7]结果，全方组终浓度为4.2 mg/mL时对血小板聚集功能及GP Ib α影响最为显著，所以各实验组中药冻干粉临用前均稀释为4.2 mg/mL浓度，经过0.22 μm的滤膜过滤除菌后，与血液标本共孵育。

1.4.4 中药干预静脉血标本 益气活血方全方及拆方组是在出血性血小板病患者血液标本中分别加入10 μL相对应的中药提取物；阴性对照组是在出血性血小板病患者血液标本中加入10 μL的0.9%NaCl注射液；正常对照组是在健康献血员血液标本中加入10 μL的0.9%NaCl注射液。将给药后血液标本在37 ℃下孵育30 min。

1.5 观察指标

Real-time PCR法检测iRhom2 mRNA表达：按照YBR Green PCR(KAPA Biosystems，货号KM4101)试剂盒说明书，通过QIAzol Lysis Reagent和氯仿提取总RNA，测定RNA浓度。使用逆转录试剂盒(TAKARA，货号639505)进行逆转录合成cDNA。引物名称及序列如下，iRhom2-F CAAGATGCCCAAGATT，iRhom2-R GGAGTAGCCAGAACGG，在Real-Time System荧光定量PCR仪(美国Bio-Rad)上进行扩增，共40个循环，每个样品重复3次，采用2-ΔΔCt法计算各组静脉血iRhom2 mRNA的相对表达水平。

ELISA法检测GP Ⅴ蛋白表达：根据试剂盒说明书，使用人GP Ⅴ ELISA试剂盒(Bioswamp，货号HM10699)定量检测各组静脉血GP Ⅴ蛋白水平。

1.6 统计学处理

2 结果

阴性对照组iRhom2 mRNA相对表达水平明显高于正常对照组，GP Ⅴ蛋白表达水平明显低于正常对照组(P<0.05)。全方组、益气活血组iRhom2 mRNA相对表达水平明显低于阴性对照组，GP Ⅴ蛋白表达水平明显高于阴性对照组(P<0.05)；全方组、益气活血组iRhom2 mRNA及GP Ⅴ表达水平与正常对照组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。黄芪当归组iRhom2 mRNA相对表达水平明显低于阴性对照组(P<0.05)；GP Ⅴ蛋白表达水平与正常对照组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。活血组iRhom2 mRNA相对表达水平明显低于阴性对照组(P<0.05)。见表1。

表1 各组iRhom2 mRNA及GP Ⅴ表达水平比较

3 讨论

研究[2-3]表明，出血性血小板病患者发病过程中，iRhom2可通过与ADAM17前体蛋白结合，激活iRhom2/ADAM17信号通路，从而促进血小板膜表面的GP Ⅴ胞外功能区过度水解，引起血小板凝血酶受体复合物活性下降，导致血小板聚集缺陷，引起皮肤、黏膜出血。根据本病临床表现，可归属于中医学“血证”范畴，益气活血方治疗本病疗效显著[1]。本次研究通过体外实验，观察了益气活血方及其拆方对出血性血小板病患者全血iRhom2及GP Ⅴ表达的影响，以进一步探讨该方及其组方药物的作用机制。

本研究结果显示，全方组、益气活血组iRhom2 mRNA相对表达水平明显低于阴性对照组，GP Ⅴ蛋白表达水平明显高于阴性对照组；全方组及益气活血组iRhom2 mRNA及GP Ⅴ表达水平与正常对照组比较，差异无统计学意义。表明出血性血小板病患者血液标本中的iRhom2 mRNA及GP Ⅴ表达在益气活血全方和益气活血中药的干预下，可恢复到健康人的水平。

黄芪当归组iRhom2 mRNA相对表达水平明显低于阴性对照组；GP Ⅴ蛋白表达水平与正常对照组比较，差异无统计学意义。表明黄芪-当归药对可起到一定治疗作用。《内外伤辨惑论》卷中记载的当归补血汤，就是由当归与黄芪按一定比例配伍而成，具有补血益气的功效，用于治疗气血两虚发热证，被称为“气血双补”代表方之一。多项研究[8]表明，黄芪-当归药对具有同类相须、相辅相成、相互促进的功效，对造血系统疾病诱发的出血、感染、贫血及血小板聚集障碍均有明显疗效。

活血组iRhom2 mRNA相对表达水平明显低于阴性对照组，表明活血药物可降低出血性血小板病患者血液标本中的iRhom2 mRNA相对表达水平，佐证中医“活血止血，祛瘀生新”治疗理论是信而有征的。活血组药物由当归、白芍、桃仁3味中药组成，含有2个中药药对配伍。其一为当归芍药散，最早源自东汉张仲景所著《金匮要略》，该方血水同调、治血为主，临床上可用于治疗血虚夹瘀之血小板过敏性紫癜、原发性痛经、月经过多等疾病[9]；体外实验[10]提示当归芍药散含药血清对血小板聚集有显著调节作用。其二为当归-桃仁药对，《证治准绳•类方》载桃仁当归汤具有祛血滞之功效，有学者[11]基于数据挖掘桃仁方剂配伍规律，发现桃仁的核心配伍组合之首为当归；体外实验[12]表明当归-桃仁药对不同配比对血小板聚集的调节作用均大于同等生药剂量的当归和桃仁单味药材。

复方中药是近年来研究的热点，其成分复杂、靶点众多。目前应用的干预方法主要有3种，包括中药提取物/纯化物直接添加、中药血清药理学及中药血浆药理学。3种添加方法各有利弊，是否选择了合适的干预方法直接影响研究结果的可信度。本文的研究对象是出血性血小板病患者静脉血标本，用实验动物制作中药血清、中药血浆无可行性，故采用中药粗提取物直接添加。

尽管本研究严格按照文献[5]中记载的方法去除杂质、调整酸碱度、制成冻干粉，临近实验时再溶解、离心、过滤等，希冀进一步减少中药杂质的理化干扰因素。但是由于中药复方或单味中药理化性质复杂，中药提取物直接添加至血液或细胞体系中影响因素仍较多。按中药学理论，白芍具有“通顺血脉，缓中，散恶血，逐贼血”功效，而本实验结果显示白芍组iRhom2 mRNA表达却明显高于阴性对照组，提示该药不适用于治疗出血性血小板病。但是在含有白芍配伍的全方组、益气活血组及活血组中，能够明显降低iRhom2 mRNA表达。究竟是单味白芍可以导致患者全血iRhom2 mRNA高表达，还是含有杂质的影响因素，或是中药复方配伍后，改变了白芍的药效，目前很难解释。尚有待更合理的中药体外研究方法建立，方能解决这类中药拆方研究中的疑点及难点。

综上所述，益气活血方全方及其部分拆方治疗出血性血小板病的机制可能与下调iRhom2 mRNA表达及上调GP Ⅴ蛋白表达有关。