唐古特大黄总蒽醌对高脂大鼠降血脂及抗动脉粥样硬化作用研究

杨昊虹，宋更选，王慧琳，孙志霞，王琳璇，谢惠春

(青海师范大学 青藏高原药用动植物资源青海省重点实验室，青海 西宁 810008)

高脂血症是诱发动脉粥样硬化(AS)的重要因素，它可引起血管内皮功能障碍形成泡沫细胞，进而促进AS的发生[1].研究证实，中药在降血脂方面具有重要作用.近年来，研究发现中药大黄有效活性成分主要由蒽醌及其衍生物、苷类化合物、鞣质类、花青素类、多糖等组成[2]，具有抗肿瘤、调节胃肠功能、抗炎、保肝及抗衰老以及降血脂等药理作用[3-7].大黄总蒽醌(Rhubarb Total Anthraquinones，RTA)作为大黄主要活性成分，包含大黄素、大黄酸、芦荟大黄素、大黄素甲醚及其葡糖糖苷等成分[8].目前，许多学者对大黄总蒽醌成分分离及提取做了大量研究[9-10]，表明大黄总蒽醌类成分具有广泛的生物活性和改善肝脏、心血管以及血脂的作用[11-14].因此，本文选用不同剂量的唐古特大黄总蒽醌提取物，研究其对高脂大鼠血脂以及动脉粥样硬化的影响，为探究唐古特大黄总蒽醌在降血脂与预防动脉粥样硬化的作用机制提供依据.

1 材料与方法

1.1 动物

SPF级SD大鼠，3月龄，体重220±20g，购自青海省西宁市地方病研究所，许可证号：医动字第14-002和14-003号.

1.2 试剂及仪器

大黄素对照品(Emodin)，批号为0431k3505(sigma公司)；胆固醇(TC)试剂盒、甘油三酯(TG)试剂盒、高密度脂蛋白(HDL-C)试剂盒、低密度脂蛋白(LDL-C)试剂盒(宁波瑞源生物科技有限公司)；丙氨酸氨基转移酶(ALT)试剂盒、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)试剂盒、碱性磷酸酶(ALP)试剂盒(中生北控生物科技有限公司)；C-反应蛋白(CRP)(山东3V生物工程集团)；钙(Ca2+)测定试剂盒(上海科华生物工程股份有限公司)；中药粉碎机(山东临清宏源制药设备有限公司)；DF-101S集热式磁力加热搅拌器(金坛市医疗仪器厂)；美国贝克曼AU2700全自动生化分析仪(美国贝克曼公司)；轮转精密切片机(浙江省金华市科迪仪器设备有限公司)；KD-T电脑生物组织摊烤片机(浙江省金华市科迪仪器设备有限公司)；Nikon ECLIPSE 50i显微镜(日本尼康公司).

1.3 药材及实验药物

唐古特大黄(RheumtanguticumMaxim.ex Regel.)采集自青海省果洛藏族自治州，经青海师范大学曾阳教授鉴定.

唐古特大黄总蒽醌提取物由前期制备，参照前人[15]方法利用大黄素为对照品绘制标准曲线，计算回归方程，再利用紫外分光光度法测定大黄总蒽醌含量，最终唐古特大黄总蒽醌回收率为3.05%.

2 方法

2.1 分组及处理

将大鼠随机分为空白对照组、阳性对照组、模型对照组、唐古特大黄总蒽醌提取物高、中、低剂量组，每组10只.除空白对照组外，其余各组大鼠一次性腹腔注射维生素D3(300000IU·kg-1)后，每日饲以高脂饲料(81.3%基础饲料、3%胆固醇、0.5%胆酸钠、0.2%丙基硫氧嘧啶、5%白糖、10%猪油)以构建高脂大鼠.各组于造模第6周开始灌胃给药，连续4周.其中，空白对照组组与模型对照组平行给予同体积生理盐水，阳性对照组灌胃辛伐他汀4.5mg·kg-1·d-1，总蒽醌提取物高、中、低剂量组分别灌胃大黄总蒽醌1.190g·kg-1·d-1、0.396g·kg-1·d-1和0.132g·kg-1·d-1.

2.2 检测指标及方法

2.2.1 观察大鼠的体重、饮食、排便等一般精神状况

2.2.2 血脂及生化指标测定

末次给药后大鼠禁食12h，心脏取血，离心后取上清液分别测定胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL-C)、低密度脂蛋白(LDL-C)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)、C-反应蛋白(CRP)以及钙(Ca2+)含量.

2.2.3 组织病理检测

剖腹取大鼠肝脏，清洗血迹并用滤纸吸尽表面水分，精确称重计算肝指数.随后，切取肝脏固定于10%福尔马林液，石蜡包埋，采用HE常规染色，光镜下观察组织病理变化情况.

取各组大鼠胸主动脉制作切片，用光学显微镜进行病理组织学检查，观察各组病变情况.

2.3 统计学处理

实验数据用SPSS 17.0进行统计学处理，结果用平均数±标准差(Mean±SD)表示.两样本均数间采用T检验进行显著性分析，多样本采用ANOVA单因素方差分析处理.P<0.05有显著性差异，P<0.01有极显著性差异，P>0.05为无显著性差异.

3 结果与分析

3.1 各组大鼠体重变化

实验初期，各组大鼠整体状态及饮食量并无明显变化，模型组体重变化略高于空白对照组.第6周大黄总蒽醌提取物灌胃后，给药各组体重随剂量增加均呈不同程度的下降，尤以大黄总蒽醌高剂量组下降最为明显.模型组于第8周左右时出现行动欠活泼、精神萎靡、进食量减少等症状，体重也有所下降，各组体重变化见表1.

表1 各组大鼠体重变化表(n=10，Mean±SD)

续表

3.2 各组血脂及生化指标比较

结果表明(表2)，大黄总蒽醌各剂量组以及阳性对照组TC、TG、LDL-C极显著(P<0.01)低于模型组但均高于空白组，其中尤以大黄总蒽醌高剂量组降低最为显著.与模型组相较，给药各组HDL-C均有不同程度的升高，然而均极显著(P<0.01)低于空白组，大黄总蒽醌高剂量组升高至空白组同一水平.

表2 唐古特大黄总蒽醌对大鼠血脂水平的影响(n=10，Mean±SD)

测定结果表明(表3)，模型组丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬门氨酸氨基转移酶(AST)、ALP指标均升高(P<0.01).与模型组比较，大黄总蒽醌各剂量组各项指标随着蒽醌剂量的增加呈下降趋势，其中大黄总蒽醌高剂量效果优于阳性对照组，能够极显著降低ALT、AST、ALP指标.

表3 唐古特大黄总蒽醌对大鼠肝脏生化指标的影响(n=10，Mean±SD)

阳性组、大黄总蒽醌高、中剂量组CRP较模型组极显著降低(P<0.01)，大黄总蒽醌中剂量组低于阳性组和大黄总蒽醌高剂量组，而大黄总蒽醌低剂量组并无显著性差异.与模型组相较，阳性对照组、大黄总蒽醌低剂量组血Ca2+值不具有统计学意义，各剂量组血Ca2+随着总蒽醌剂量的增加呈下降趋势，尤以高剂量血降Ca2+极显著(P<0.01)，见表4.

表4 唐古特大黄总蒽醌对大鼠Ca2+和CRP的影响(n=10，Mean±SD)

3.3 各组大鼠组织病理变化

大鼠肝指数结果显示(表5)，给药组大鼠肝系数随着大黄蒽醌浓度呈正相关，其中大黄总蒽醌高剂量肝指数与模型组相比较具有显著性差异(P<0.05)，大黄总蒽醌低剂量组不具显著性差异.

表5 各组大鼠肝系数比较(n=10，Mean±SD)

光镜检查结果显示(图1)，模型组(B)肝小叶结构紊乱，肝细胞肿胀，核仁挤压至边缘且核膜增厚，同时细胞间隙出现胆汁淤积现象，肝组织可见明显脂肪变性.与模型组相较，各给药组均有不同程度好转，脂肪变性减弱，脂滴减少，未出现明显胆汁淤积现象，其中大黄总蒽醌高剂量组(F)病变显著减轻，中剂量组(E)和低剂量组(D)差异不大，然而各给药组相对于正常对照组肝细胞肿大，核膜增厚清晰可见.

主动脉组织学形态检查结果见图2，空白组大鼠(A)胸主动脉内膜、中膜和外膜结构完整且清晰可见，未见异常改变.模型组(B)内皮下有大量泡沫细胞堆积以及脂质堆积，中膜平滑肌细胞有不同程度的萎缩，内膜表面纤维组织增生，具有明显的病变形态.大黄总蒽醌高剂量组(F)血管内膜明显变薄且厚度大致均一，结构完整，弹性内膜连续，表面光滑，在中膜层中弹性膜连续无断裂，平滑肌环形紧凑排列，平滑肌细胞形态和大小正常且分布均匀，与中、低剂量组(E、D)相比主动脉病变稍轻，无病变的主动脉壁、内膜、中膜、外膜均清晰可见，各层结构正常，且内皮细胞下有泡沫细胞明显少于中、低剂量组，因此大黄总蒽醌高剂量组的药效更为突出.

注：图中箭头所指为泡沫细胞图2 不同处理组胸主动脉组织形态学变化(×400)

4 讨论

高脂血症是诱发动脉粥样硬化(AS)的重要因素[16].研究结果表明，血浆中TC、TG水平升高，与LDL结合后形成LDL-C转运至动脉管壁，造成脂质沉积引起慢性炎症反应加速AS的发展[17].然而，HDL-C含量与AS形成呈负相关，能够抵制动脉粥样硬化的形成.因此，改善脂质代谢是预防AS形成的一个关键因素.本研究结果表明，唐古特大黄总蒽醌提取物干预后，大鼠TC、TG、LDL-C的含量减少，HDL-C含量升高，尤以高剂量组效果最为显著，这与前人研究结果一致[18-20]，说明大黄总蒽醌能够调节脂质代谢进而改善AS的形成，但是其作用存在剂量效应性.

AS的发生往往伴随着脂肪肝等肝脏疾病的出现，脂肪过度摄入导致体内脂质代谢紊乱甚至造成肝损伤，因此脂肪堆积在肝脏，影响肝细胞的功能造成结缔组织增生，最终导致肝硬化.AS通常会导致体内脂质代谢紊乱，甚至会导致脂肪肝.长期高脂食物的摄入导致肝脏脂肪变性，引起肝脏代谢功能异常，从而促进AS的形成.本研究中，高脂饮食导致模型组大鼠血脂、胆固醇水平增高，造成肝组织损伤，导致肝细胞脂肪变性及点状坏死，致使血清AST、ALT和ALP显著升高.从表3中发现，大黄总蒽醌能明显改善AST、ALT、ALP水平，减轻高脂饮食造成的肝损害，间接说明了对肝细胞的保护作用，且组织切片结果显示大黄总蒽醌从改善肝小叶结构、肝细胞形态、脂肪变性程度等方面对肝脏进行保护，说明大黄总蒽醌对脂质代谢紊乱所引起的脂肪肝有较好改善作用，从而进一步预防AS的发病.

血钙升高可诱发高钙血症[21]，高钙血症与高脂血症协同会造成动脉管壁受损，引起脂蛋白渗透内膜，进而诱发AS斑块[22].本实验中，与高脂模型组相较，大黄总蒽醌给药组的血钙含量降低，这一结果证明了大黄总蒽醌有一定的清除血钙的能力，从而抑制血管钙化.除此之外，大量实验证明炎症细胞因子也是导致AS的一个关键原因[23].CRP作为炎症敏感性指标，其含量与AS的形成呈正相关.本研究中，大黄总蒽醌给药组以及阳性组的CRP值极显著(P<0.01)低于模型组，说明大黄总蒽醌具有一定的抗炎作用，进而影响AS的形成，其机制可能是由于大黄总蒽醌能够有效地减轻肝损伤，从而减少CRP的分泌.

大量研究显示，动脉粥样硬化等心脑血管疾病的发生与机体脂质代谢异常作用密切相关.因此，设法调节机体脂质代谢水平是预防动脉粥样硬化等心脑血管疾病的积极途径之一[24].本实验采用高脂饲料喂养SD大鼠构建高脂大鼠模型，高脂饲料饲养的大鼠的体质量均明显高于普通饲料组，各组大鼠经HE染色后发现，高脂饲料组大鼠动脉出现平滑肌细胞增生，并向内膜下迁移，内膜水肿，明显的泡沫状脂质颗粒沉积，说明高脂大鼠具有典型的AS症状，而大黄总蒽醌对AS有一定抑制作用，其中高剂量大黄总蒽醌作用下胸主动脉修复效果较好，胸主动脉中泡沫细胞以及血管壁上的病变明显减少，与阳性对照组动脉壁形态接近正常对照组，这一结果提示大黄总蒽醌对高脂大鼠主动脉的影响随着剂量的增加效果逐步明显，至高剂量与辛伐他汀用相似，这与前人研究中大黄活性成分的作用效果有剂量依赖关系较为一致[25]，造成这一结果可能与大黄总蒽醌具有调节脂质以及保肝作用密切相关，然而关于唐古特大黄总蒽醌是如何调节相关信号通路来抑制AS的形成还需进一步研究.