氯氰菊酯通过调控miR-409b对青春期鼠雄性生殖系统的影响及作用机制

徐玮 邵颖颖 杜二球

[摘要] 目的 探討氯氰菊酯对青春期雄性大鼠生殖系统的影响及相关机制。 方法 随机将40只SD健康青春期雄性大鼠分为正常组和低、中、高剂量组各10只，四组大鼠分别进行干预。采用RT-PCR法检测miR-409b、miR-30b-3p表达，检测各组大鼠生殖系统重量，检测精子生成、存活情况，采用免疫透射比浊法检测性激素、氧化应激指标水平。 结果 高剂量组miR-409b、miR-30b-3p表达、精囊重量高于低、中剂量组（P<0.05），前列腺、睾丸、附睾重量及精子数量、每日精子生成量、精子成活率低于低、中剂量组（P<0.05）。高剂量组T、LH水平低于低、中剂量组（P<0.05），FSH、LPO、TAS、ROS水平高于低、中剂量组（P<0.05）。 结论 氯氰菊酯干预能够调控青春期雄性大鼠miR-409b、miR-30b-3p表达，影响大鼠生殖系统发育、精子生成、存活及性激素水平，其机制可能是氯氰菊酯干预能够引起睾丸氧化应激反应。

[关键词] 氯氰菊酯;生殖系统;氧化应激;睾丸;性激素;精囊;精子生成

[中图分类号] R392.5          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-9701（2021）28-0027-04

Effect of cypermethrin on reproductive system of adolescent male rats through regulation of miR-409b and mechanisms

XU Wei1   SHAO Yingying2   DU Erqiu1

1.Department of Obstetrics and Gynecology， Taizhou Central Hospital in Zhejiang Province， Taizhou University Hospital， Taizhou 318000， China; 2.Department of Gastroenterology， Taizhou Hospital of Zhejiang Province affiliated to Wenzhou Medical University， Taizhou   317000， China

[Abstract] Objective To explore the effect of cypermethrin on reproductive system of adolescent male rats and related mechanisms. Methods A total of 40 healthy male SD rats were randomly divided into the normal group， the low-dose group， the medium-dose group， and the high-dose group， with 10 rats in each group. The four groups were intervened separately. The RT-PCR method was used to detect the expression of miR-409b and miR-30b-3p. The weights of reproductive system of rats in each group were collected. The spermatogenesis and survival status were recorded. The immunoturbidimetric method was used to detect the levels of sex hormones and oxidative stress indicators. Results The expression of miR-409b and miR-30b-3p and weight of seminal vesicles in the high-dose group were higher than those in the low-and medium-dose groups（P<0.05）. The weight of prostate， testes and epididymis， number of sperm， daily spermatogenesis， and sperm survival rate in the high-dose group were lower than those in the low-and medium-dose groups（P<0.05）. The levels of T and LH in the high-dose group were lower than those in the low-and medium-dose groups（P<0.05）， while the levels of FSH， LPO， TAS， and ROS in the high-dose group were higher than those in the low-and medium-dose groups （P<0.05）. Conclusion Cypermethrin intervention can regulate expression of miR-409b and miR-30b-3p in adolescent male rats， and affect development of reproductive system， spermatogenesis， survival， and sex hormone levels. The mechanism may be that cypermethrin intervention can cause testicular oxidative stress.

[Key words] Cypermethrin; Reproductive system; Oxidative stress; Testes; Sex hormones; Seminal vesicles; Spermatogenesis

據不完全统计，我国农业不断发展，农药应用范围较为广泛，由农药引起的人体健康问题日益增多，引起广大专家学者的关注[1-2]。现阶段农药污染已成为我国主要的环境污染源之一，长期生活于农药污染环境中会对人体健康造成一定的影响，主要表现为农药对人体生殖系统、神经系统、免疫系统的危害。有研究表明，长期、大量氯氰菊酯暴露会对机体造成一定的危害[3]。氯氰菊酯为我国常用的菊酯类农药，应用范围包含林业、农业、公共卫生等各个领域，具有高效、毒性较小的特点。但是，近年来有专家在空气、土壤中发现大量的氯氰菊酯残留[4-5]。基于此，有学者设计动物实验探讨氯氰菊酯的毒害作用发现，氯氰菊酯可能对雄性生殖系统造成一定的影响，但其具体作用机制尚未研究透彻[6]。本研究使用氯氰菊酯对青春期雄性大鼠进行干预，探讨其机制，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料来源

选取40只SD健康青春期雄性大鼠[广东君睿生物技术研究有限公司，使用许可证号：SYXK（粤）2020-0217]，年龄9～10周，平均（9.5±0.4）周;体重223～247 g，平均（235.2±9.6）g。在相对湿度50%～55%、温度（22.9±3.1）℃的环境中喂养1周，光照12 h/d。本研究获得我院医学伦理委员会批准。

主要试剂：氯氰菊酯（成都科利隆生化有限公司，国药准字H20190901）;小鼠抗兔miR-409b抗体（美国Selleck公司，批号：S8753）;兔抗小鼠miR-30b-3p抗体（美国Invitrogen公司，批号：C1358）;兔抗大鼠LH、FSH抗体（美国Hyclone公司，批号：A25291，A23652）;大鼠抗小鼠T抗体（丹麦Dako公司，批号：D9231）;小鼠抗大鼠LPO抗体（美国Gibco公司，批号：A26135）;兔抗大鼠TAS抗体（美国Sigma公司，批号：D9423）;小鼠抗兔ROS抗体（美国BD公司，批号：N3667）。

1.2 方法

1.2.1 建模及分组干预  采用随机数字表法将40只SD健康青春期雄性大鼠分为正常组和低、中、高剂量组各10只。正常组大鼠平均年龄（9.4±0.5）周，平均体重（236.1±9.9）g;低剂量组大鼠平均年龄（9.5±0.3）周，平均体重（234.6±8.7）g;中剂量组大鼠平均年龄（9.4±0.5）周，平均体重（235.8±9.2）g;高剂量组大鼠平均年龄（9.6±0.4）周，平均体重（236.7±10.3）g。四组大鼠一般资料比较，差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。取氯氰菊酯，使用玉米油配置20、40、60 mg/kg氯氰菊酯溶液，分别对低、中、高剂量组大鼠灌胃处理，连续处理15 d，正常组大鼠使用生理盐水灌胃处理，连续处理15 d。

1.2.2 检测方法  ①采用RT-PCR法检测miR-409b、miR-30b-3p表达。取各组大鼠腹部静脉血3 mL，使用2000 r/min离心机（湖南凯达科学仪器有限公司，型号：KL05R）离心处理15 min后-40℃保存。取TRIzol试剂（广州济恒医药科技有限公司）添加至血清标本，静置15 min后添加600 μL三氯甲烷进行搅拌，直至混合溶液颜色变为乳白色，将其置于4℃环境保存15 min后取出进行离心处理，取上清液，等量添加异丙醇后再次离心处理，1 mL 75%乙醇洗涤后提取总RNA，测试完整性，合成cDNA，逆转录处理后行PCR扩增，2-△△Ct方法计算微小RNA-409b（miR-409b）、微小RNA-30b-3p（miR-30b-3p）表达。

1.2.3 生殖系统重量检测  对各组大鼠麻醉处理后，颈椎脱臼法处死，取各组大鼠精囊、前列腺、睾丸、附睾组织，使用5℃生理盐水清洗血液后将表面水分吸干，称重并记录。

1.2.4 免疫组化染色  取大鼠睾丸组织，并切做2 mm×2 mm小块，反复清洗后浸泡于福尔马林溶液。脱水后石蜡包埋、切片、脱蜡水化。柠檬酸修复液煮沸后加入切片，2 min后开盖，PBS液清洗3次。滴加POD阻断剂，30 min后PBS液清洗，滴加一抗4℃过夜。次日吸除一抗后PBS液清洗，滴加二抗，常温孵育30 min后PBS液清洗，DAB染色，并使用显微镜观察。苏木精染核、反蓝、脱水处理后封片。

1.2.5 精子生成、存活情况检测  取部分睾丸组织，添加25 mL SMT溶液（上海尚宝生物有限公司）后制作匀浆液，使用细胞计数板（广州济恒医药科技有限公司）对精子数量进行统计，并计算每日精子生成量及精子成活率，每日精子生成量=精子计数池均值×方格系数×细胞计数板系数×稀释倍数/（匀浆重量×精子平均生成时间）。

1.2.6 免疫透射比浊法检测性激素、氧化应激指标水平  取各组大鼠血清标本进行稀释，准备3个洁净试管标记为对照管、标准管、检测管，均添加350 μL缓冲液，之后3管分别添加20 μL蒸馏水、标准液、血清标本震荡均匀，置于37℃保温箱（北京福意电器有限公司，型号：FYL-YS-150L）中保存15 min，比色，于340 nm、700 nm波长处测定免疫复合物浊度，根据吸光度计算睾酮（T）、促黄体生成素（LH）、促卵泡生成素（FSH）及过氧化脂（LPO）、总抗氧化态（TAS）、活性氧（ROS）水平。

1.3 统计学方法

采用SPSS 26.0统计学软件进行数据分析，计量资料以（x±s）表示，多组比较进行方差分析，组间比较采用独立样本t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠miR-409b、miR-30b-3p表达比较

低、中、高剂量组miR-409b、miR-30b-3p表达高于正常组，差异有统计学意义（P<0.05）;高剂量组miR-409b、miR-30b-3p表达高于低、中剂量组，差异有统计学意义（P<0.05）。见表1、封三图3。

2.2 各组大鼠生殖系统重量比较

低、中、高剂量组大鼠精囊重量高于正常组，前列腺、睾丸、附睾重量低于正常组，差异有统计学意义（P<0.05）;高剂量组大鼠精囊重量高于低、中剂量组，前列腺、睾丸、附睾重量低于低、中剂量组，差异有统计学意义（P<0.05）。见表2。

2.3 各组大鼠精子生成、存活情况比较

低、中、高剂量组大鼠精子数量、每日精子生成量、精子成活率低于正常组，差异有统计学意义（P<0.05）;高剂量组大鼠精子数量、每日精子生成量、精子成活率均低于低、中剂量组，差异有统计学意义（P<0.05）。见表3。

2.4 各组大鼠性激素水平比较

低、中、高剂量组大鼠T、LH水平低于正常组，FSH水平高于正常组，差异有统计学意义（P<0.05）;高剂量组大鼠T、LH水平低于低、中剂量组，FSH水平高于低、中劑量组，差异有统计学意义（P<0.05）。见表4。

2.5 各组大鼠氧化应激指标水平比较

低、中、高剂量组大鼠LPO、TAS、ROS水平高于正常组，差异有统计学意义（P<0.05）;高剂量组大鼠LPO、TAS、ROS水平高于低、中剂量组，差异有统计学意义（P<0.05）。见表5。

3 讨论

本研究结果显示，使用氯氰菊酯干预的青春期雄性大鼠精囊重量上升，前列腺、睾丸、附睾重量下降，且随着氯氰菊酯干预剂量的上升，这种变化趋势更明显。现阶段农药污染已成为我国主要的环境污染源之一，人体长期生活于农药污染环境中会对其健康造成一定的影响，其中主要体现在对机体生殖系统的危害[7-9]。有研究表明，氯氰菊酯暴露下的雄性大鼠生殖系统受到一定程度的影响，主要体现在前列腺、睾丸、附睾等组织重量出现明显变化[10]。本研究结果表明，在氯氰菊酯干预下，青春期雄性大鼠生殖系统受到一定的影响，且这种影响程度与氯氰菊酯剂量具有一定相关性。上述实验发现，氯氰菊酯能够影响青春期雄性大鼠生殖系统，本研究推测其机制可能是氯氰菊酯干预能够调控生殖相关基因表达，从而起到影响机体生殖系统的作用。本研究结果显示，使用氯氰菊酯干预的青春期雄性大鼠miR-409b、miR-30b-3p表达上调，随着氯氰菊酯干预剂量的上升，miR-409b、miR-30b-3p表达上调幅度更加明显。微小RNA（miRNA）广泛存在于大多数生物中，具有组织特异性、稳定性、保守性等特点，与机体多种生物学行为密切相关。有研究表明，大量miRNA在机体生殖系统损伤中发挥重要作用[11-14]，其中miR-409b、miR-30b-3p表达变化与机体生殖系统状况具有密切联系。本研究结果表明，氯氰菊酯干预能够调控miR-409b、miR-30b-3p表达，从而导致大鼠生殖系统损伤，为机体生殖系统损伤的治疗提供新的靶点和研究方向。

本研究结果显示，使用氯氰菊酯干预的青春期雄性大鼠精子数量、每日精子生成量、精子成活率均出现下降。本研究前期实验显示，在氯氰菊酯的干预下，青春期雄性大鼠睾丸发育受到严重影响，由此推测在氯氰菊酯的影响下，大鼠精子生成、成活情况会受到一定的影响。有研究表明，氯氰菊酯干预下会影响雄性大鼠生殖系统，从而对大鼠精子生成造成一定的影响。本研究结果表明，氯氰菊酯干预对青春期雄性大鼠精子生成、存活造成一定的影响，这一情况的出现原因与氯氰菊酯干预影响雄性大鼠睾丸发育具有密切联系。

本研究结果显示，使用氯氰菊酯干预的青春期雄性大鼠T、LH水平下降，FSH水平上升。前期实验显示，在氯氰菊酯的干预下，青春期雄性大鼠生殖系统发育受到一定的影响，由此推测氯氰菊酯干预可能会对大鼠性激素分泌造成一定的影响。T、LH、FSH为常用的性激素指标，三者水平变化与机体生殖系统状况具有密切联系[15-17]。本研究结果表明，氯氰菊酯干预能够影响青春期雄性大鼠的性激素分泌。

本研究结果显示，使用氯氰菊酯干预的青春期雄性大鼠LPO、TAS、ROS水平上升。生殖系统损伤的发生发展伴随着机体生殖系统氧化应激反应，LPO、TAS、ROS为广谱的氧化应激指标，三者水平变化与氧化应激反应严重程度具有密切联系[18-20]。本研究结果表明，氯氰菊酯干预能够调控LPO、TAS、ROS水平，导致青春期雄性大鼠睾丸组织发生氧化应激反应，从而对大鼠生殖系统造成一定的损伤。

综上所述，氯氰菊酯干预能够调控青春期雄性大鼠miR-409b、miR-30b-3p表达，并对大鼠生殖系统造成一定的影响，主要表现为影响大鼠前列腺、睾丸、附睾、精囊发育，影响精子生成、存活及性激素水平，其作用机制可能是氯氰菊酯干预能够引起大鼠睾丸组织发生氧化应激反应。

[参考文献]

[1] 李书锐，王日兴，李诗阳. 还原型谷胱甘肽联合血液灌流对中老年急性有机磷农药中毒患者肝、肠胃及神经功能的改善效果[J]. 中国老年学杂志，2020，40（13）：2817-2821.

[2] 高珣，陈铭莉，王玉凤，等. 无创血流动力学监测在急性中重度农药中毒病情评估中的作用[J]. 中华劳动卫生职业病杂志，2020，38（12）：881-885.

[3] Cunha EO，Reis AD，Macedo MB，et al. Ototoxicity of cypermethrin in Wistar rats[J]. Braz J Otorhinolaryngol，2020，86（5）：587-592.

[4] 姜波，王斌，王晓，等. 乙体氯氰菊酯亚急性染毒对小鼠脑组织谷氨酸代谢的影响[J]. 毒理学杂志，2020，34（5）：400-404.

[5] Yadav A，Tandon A，Seth B，et al. Cypermethrin impairs hippocampal neurogenesis and cognitive functions by altering neural fate decisions in the rat brain[J]. Mol Neurobiol，2021，58（1）：263-280.

[6] 胡金霞，王红梅，杨向东，等. 氯氰菊酯对成年雄性大鼠生殖系统及雄激素受体表达的影响[J]. 徐州医学院学报，2011，31（2）：89-93.

[7] Gottardi M，Birch MR，Dalhoff K，et al. The effects of epoxiconazole and α-cypermethrin on Daphnia magna growth，reproduction，and offspring size[J]. Environ Toxicol Chem，2017，36（8）：2155-2166.

[8] Alalwani AD. Nephrotoxicity of cypermethrin in rats. Histopathological aspects[J]. Histol Histopathol，2020，35（12）：1437-1448.

[9] Katragadda V，Adem M，Mohammad RA，et al. Testosterone recuperates deteriorated male fertility in cypermethrin intoxicated rats[J]. Toxicol Res，2020，37（1）：125-134.

[10] 李媛媛，张媛媛，李俊霞，等. 甲维盐和高效氯氰菊酯混配染毒对雄性小鼠睾丸生化指标及精子质量的影响[J]. 环境与职业医学，2020，37（8）：804-807.

[11] 刘超，武思宇，华进联. MiR-34c在奶山羊雄性生殖干细胞增殖分化中的作用[J]. 中国生物化学与分子生物学报，2016，32（5）：569-577.

[12] 宁金卓，程帆，余伟民，等. MiR-29a靶向调控瞬时受体电位通道家族4在睾丸缺血再灌注损伤中对GC-1细胞增殖及凋亡的影响及作用机制[J]. 国际泌尿系统杂志，2021，41（1）：124-128.

[13] 董涵，侯开领，周静，等. 睾丸转染miR-383对KM小鼠精子凋亡的影响[J]. 西部医学，2018，30（6）：813-818.

[14] 寧金卓，卓栋，程帆. lncRNA MALAT1靶向调控miR-214在睾丸缺血再灌注损伤中的作用及其机制[J]. 皖南医学院学报，2021，40（1）：13-17.

[15] 徐虎军，卫培峰，高峰，等. 沙棘柴术胶囊治疗单纯性肥胖的临床疗效及其对性激素T、LH/FSH的影响[J]. 西部中医药，2020，33（9）：81-84.

[16] 马晓宇，倪继红，杨露露，等. GnRHa治疗对特发性中枢性性早熟和快速进展型早发育儿童的远期影响[J]. 中华内分泌代谢杂志，2020，36（1）：58-62.

[17] 肖戈，尹杰，陈向新，等. MSV术与开放手术治疗精索静脉曲张性不育症效果及对患者FSH、LH、T水平影响[J]. 中国计划生育学杂志，2021，29（2）：319-323.

[18] 朱心强， 郑一凡， 张群卫，等. 硫丹对成年大鼠生精功能的影响和氧化损伤[J]. 中国药理学与毒理学杂志，2002， 16（5）：391-395.

[19] 龚晋，吴东波，张兰兰，等. PCO模型大鼠卵巢组织氧化应激水平的研究[J]. 四川大学学报（医学版），2015， 46（2）：238-242，247.

[20] 周茜，杨林，张文静，等. 薯蓣皂苷元对少弱精子症小鼠精子质量和生殖系统氧化应激损伤的影响[J]. 湖北文理学院学报，2017，38（5）：85-88.

（收稿日期：2021-05-21）