2株拮抗放线菌复合防治番茄青枯病的研究

赖宝春，姚锦爱，戴瑞卿，吴振强，王家瑞

（1. 福建省漳州市农业科学研究所，漳州 363005；2. 福建省作物有害生物监测与治理重点实验室/福建省农业科学院植物保护研究所，福州 350013）

由茄科劳尔氏菌Ralstonia solanacearum引起的番茄青枯病是一种世界范围的细菌性维管束病害，能侵染 200多种植物，包括茄科农作物和观赏类植物[1]。生产上防控该病的方法主要有施用化学农药[2]、选育抗病品种[3]、嫁接或轮作[4]、土壤改良[5]等，但都存在明显的弊端。近年来，拮抗微生物菌剂因其高效、生态安全、成本低、专一性强且能促进植株生长等优点已成为植物青枯病生物防治的首选。已筛选出的微生物菌剂包括单一菌剂和复合菌剂。单一菌剂主要有芽胞杆菌[6,7]、无致病力青枯雷尔氏菌[8]、假单孢菌[9]、链霉菌[10,11]等。但考虑到青枯病菌是一种破坏性极强的土传细菌，在土壤、水和植物中存活时间长，单一菌剂防效不理想，存在诸如持效性差，环境依赖性强等，难以达到理想的防治效果[12]。而复合菌剂具有提高生物防治效果及延长生防菌作用期限等优点，已成为新的研究热点，目前有关利用复合菌剂防治青枯病的报道多集中于生防细菌的复配，王丽丽等[13]将健康番茄根际分离到的2株芽胞杆菌混合后，对番茄青枯病的防治效果明显优于单一菌株。李程等[14]将2株解淀粉芽胞杆菌ZM9和YH-22复合后对烟草青枯病菌的抑菌圈直径显著大于单一菌株处理。吕建林等[15]将短短芽胞杆菌B011和侧孢芽胞杆菌2-Q-9混合后对烟草青枯病的防效优于单一菌株，达 83.39%。黄小琴等[16]用解淀粉芽胞杆菌和硫酸链霉素混配后，对烟草青枯病的防效达65.85%，且能减少一半化学农药的施用量。因此，通过复合菌剂来提高番茄青枯病的防治效果显得尤为重要。

有关生防放线菌复合防治番茄青枯病的研究较少。而放线菌中应用最多的是链霉菌，链霉菌已被报道应用于防治多种植物的青枯病，还能促进植株生长[17,18]。链霉菌的代谢产物能产生多种活性物质，如丰加霉素、环二肽、四烯大环内酯类抗生素等[19,20]。且生产上应用的诺尔霉素、水合霉素、中生菌素等农用抗生素对番茄青枯病均具有良好的防治效果[21]。Amano等[22]、Smaoui等[23]报道的灰锈赤链霉菌能产多种抗生素及抗真菌纯化合物。Wadetwar等[24]、包慧芳等[25]报道的深红紫链霉菌除了能产生胞外抗生素，还具有α-淀粉酶、酯酶、脂肪酶的活性。因此，探索链霉菌复合防控番茄青枯病具有重要的现实意义。

本研究的生防菌株灰锈赤链霉菌（FX81）和深红紫链霉菌（FX28）前期已证实对土传病原真菌镰刀菌具有良好的抑制作用，抑菌谱广，且能致真菌菌丝畸变，具强烈抑制病菌孢子萌发的能力[26-28]。为进一步评价这2株放线菌对土传病原细菌的抑制作用，我们进行了单菌株对番茄青枯病菌的皿内初筛后，发现这2株放线菌均对番茄青枯病菌有较强的抑制作用。因此，本研究从生防放线菌多菌复合协同增效的角度出发，研究2株拮抗放线菌复合对番茄青枯病的防治效果及其对番茄植株的促生作用，以期为番茄青枯病微生物菌肥的开发及应用提供理论依据和菌种资源。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试拮抗放线菌：灰锈赤链霉菌Streptomyces griseorubiginosus（FX81）和深红紫链霉菌Streptomyces violaceorubidus（FX28）菌株，均由漳州市农业科学研究所植物保护研究室筛选保藏。

供试病原菌：番茄青枯病菌R. solanacearum（QK1）由漳州市农业科学研究所植物保护研究室分离、鉴定、保藏。

试验番茄品种：“西研958”（西安秦蔬农业有限公司），由漳州市农业科学研究所蔬菜研究室提供。

1.2 拮抗菌株间亲和性的测定

将100 mL高氏一号液体培养基加入250 mL的三角瓶中，121 ℃高压灭菌30 min，待冷却后分别单独接入菌株FX81和FX28的5 mm菌饼各5块，28 ℃、150 r/min振荡培养7 d，制成1.0×108cfu/mL菌株发酵液备用；采用对峙培养法将2株菌株的发酵液交叉滴于同一个高氏一号培养基平板上，重复3次。28 ℃对峙培养5～7 d，观察2株菌株的生长情况及相互之间有无拮抗作用。

1.3 单一及复合拮抗菌离体抑菌作用测定

按1.2的方法同时接入菌株FX81和FX28的5 mm菌饼各3块，制成1.0×108cfu/mL的复合发酵液备用。采用杯碟法。将培养好的番茄青枯菌液100 μL（浓度为3.0×106cfu/mL）与培养基混匀后倒入放置牛津杯的平板，待凝固后取出牛津杯，在孔中加入200 μL的待测单一或复合拮抗菌的发酵液，培养48 h后测定透明抑菌圈的大小[29]。

1.4 单一及复合菌剂对番茄青枯病的防治效果

1.4.1 单一及复合菌剂的制备 单一及复合固体发酵基质配方及固体菌剂发酵参考赖宝春等[26]的方法制备。即将优化好的猪粪与麦麸质量比为4:6装入250 mL三角瓶中，每瓶加发酵原料总量20 g，控制料水比为1:0.8，调节pH至7.2～7.5，121 ℃灭菌20 min，即为固体发酵基质（命名为GC）。按15%接种量接入单一及复合发酵液，28 ℃恒温培养，待瓶壁及固体培养基中长满菌丝，并散发出典型的“土腥味”，即完成单一及复合固体菌剂发酵，分别命名为BOF28、BOF81、BOF8128，菌剂中拮抗菌的含量达到108cfu/g。1.4.2 盆栽防治效果测定 番茄种子催芽后播种于穴盘，待番茄幼苗长至12 cm时，挑选长势一致的番茄幼苗移栽到花盆（直径25 cm）中，每盆1株苗，试验设6个处理，分别为CK1（空白对照）、CK2（与固体发酵基质相当的常规化肥对照）、GC（固体发酵基质）、BOF81（含FX81菌株的菌剂）、BOF28（含FX28菌株的菌剂）、BOF8128（含2株菌比例为1:1的复合菌剂），固体发酵基质和固体菌剂用量为2%（质量分数），与土壤混匀。每个处理10盆，3次重复。处理7 d后，每盆根部接种青枯菌液5 mL（浓度为3.0×106cfu/mL），接种45 d后采集各处理的根际土样，利用SMSA培养基平板稀释涂布法计数青枯病菌的数量[30]；并调查发病率和病情指数，计算防治效果，病害分级标准参照王丽丽等[13]的方法。发病率（%）＝发病株数/调查总株数×100，病情指数＝Σ（病级数×该病级植株数）/（最大病级数×植株总株数）×100，防治效果（%）＝（对照组病情指数－处理组病情指数）/对照病情指数×100。

1.4.3 生物量的测定 按1.4.2的方法播种、移栽和管理，45 d后将各处理的健康番茄植株连根拔起带回实验室，将植株地上部洗净后装入大牛皮纸袋中，105 ℃杀青0.5 h后，80 ℃烘至恒质量，测定植株干质量，分析生防放线菌复合菌剂对番茄植株的促生作用。

1.5 数据统计与处理

试验数据处理采用DPS 7.5软件进行分析，Duncan氏新复极差法进行差异显著性检验。

2 结果与分析

2.1 2株拮抗放线菌亲和性的测定

将菌株FX81和FX28在高氏一号培养基上共培养的生长情况进行观察，可见2株菌株之间能够重叠生长，菌落之间未观察到明显的抑菌带，即表明2株菌株之间无明显抑制作用，可以进行复合发酵或将菌液进行复配（图1）。

图1 菌株FX81和FX28的共培养Fig. 1 Co-culture of FX81 and FX28

2.2 单一及复合拮抗菌株对番茄青枯病菌的抑制作用

2株放线菌单一菌株或复合菌株发酵液对番茄青枯病菌均有较强的抑制作用，菌株FX81单一发酵液抑菌圈平均直径为（27.0±0.43）mm（图2B），菌株FX28单一发酵液抑菌圈平均直径为（28.8±0.62）mm（图2C），复合拮抗菌发酵液抑菌圈平均直径达（36.0±0.46）mm（图2D）。结果表明，拮抗放线菌复合发酵液处理组对番茄青枯病菌的抑菌效果优于单一菌株处理组，说明2株放线菌对番茄青枯病菌具有的协同抑制作用。

图2 单一菌株及复合菌株对番茄青枯病菌的拮抗效果Fig. 2 Inhibitory effect of strain single and compound against R. solanacearum

2.3 单一及复合菌剂对番茄青枯病的防治效果

2.3.1 单一及复合菌剂对番茄生物量的影响 从表1可以看出，单施固体发酵基质（GC）与常规化肥对照（CK2）相比无明显促生效果，各菌剂处理可显著提高番茄地上部干质量，施用单一菌剂BOF81和BOF28番茄地上部干质量分别比空白对照（CK1）增加54.49%和46.51%；施用复合菌剂BOF8128对番茄生物量影响最显著，与空白对照（CK1）相比增加76.58%，与单一菌剂BOF81和BOF28相比，分别增加14.31%和20.52%。说明复合菌剂BOF8128在促进番茄地上部分生长方面显著优于单一菌剂。

表1 单一及复合菌剂对番茄地上部干质量的影响Table 1 Effects of single and compound microbial agents on dry weight of tomato shoot

2.3.2 单一及复合菌剂对番茄根际病原菌数量的影响 从图3结果可以看出，菌剂可显著影响番茄根际青枯菌的数量，接种青枯菌45 d后，空白对照（CK1）青枯菌的数量达1.7×108cfu/g，显著高于菌剂处理。施用单一菌剂BOF81和BOF28青枯菌数量分别为1.4×107cfu/g和1.9×107cfu/g，与空白对照（CK1）相比，青枯病菌数量增长较缓慢。而施用复合菌剂BOF8128青枯菌数量为2.8×106cfu/g，对番茄根际青枯菌数量的影响最显著，比接种时青枯菌数量3.0×106cfu/g略低，表明复合菌剂比单一菌剂在抑制青枯菌数量增长方面效果更好。

图3 不同处理组对青枯病菌数量的影响Fig. 3 Effects of different treatments on the number of R. solanacearum

2.3.3 单一及复合菌剂对番茄青枯病的防治效果 接种病原菌45 d后，空白对照（CK1）发病严重，发病率达76.67%，单一及复合菌剂的处理BOF8128、BOF81和BOF28均能显著抑制青枯病的发生，病情指数分别为11.67、15.83和20.0。复合菌剂BOF8128对番茄青枯病的防治效果82.03%，显著高于单一菌剂处理BOF28防效69.15%（表2）。

表2 不同处理组对番茄青枯病的防控效果Table 2 The control effect of different treatments on tomato bacterial wilt in greenhouse

3 讨论

链霉菌对植物病原菌的抑制作用机制之一是产生抗生素，其与病原细菌之间常见有透明的抑菌圈，与病原真菌之间常见有透明的抑菌带，说明它们分泌出抗菌素类物质[10]，虽然链霉菌对多种植物的青枯病表现出较好的防效，但大多单一菌株的生防持效性差，防效不理想。将不同作用机制、不同生长条件和不同生态适应性等特点的拮抗菌株共同作用，能提高防病效果和稳定性[31]。因此，将无明显拮抗作用的生防菌株复合培养，菌株间通过协同作用实现优势互补，发挥出理想的生防效果。前期试验发现菌株FX81生态适应性强，能降低香蕉根际土壤中病原菌的数量，对香蕉枯萎病的防治效果达81.05%，且能促进香蕉植株生长[26]。菌株FX28有较强的抑制病菌孢子萌发的能力，对蜜柚炭疽病菌孢子的萌发抑制率达97.0%，对蜜柚炭疽病的预防效果和治疗效果分别为83.8%和71.1%[27]。本试验将这2株放线菌交叉培养后，发现它们之间无明显拮抗作用，进一步试验结果表明2株菌株复合培养后对番茄青枯病菌的抑菌圈平均直径显著大于单一菌株的抑菌圈平均直径，与前人研究结论一致。

葛红莲等[32]将5株生防细菌复配后浇灌对盆栽辣椒青枯病的防治效果达到91.1%，优于任何单一菌株，田间采用拌菌堆肥法（添加营养载体）和浇灌法的防治效果分别为94.0%和77.0%，增产效果分别为367.0%和57.8%。李勤奋等[33]研究了复合菌液C1、C2蘸根（未添加营养载体）处理对盆栽番茄的抗病促生作用，结果表明复合菌液C1、C2均能明显促进番茄植株生长，以复合菌剂C2对番茄青枯病的防治效果最好，达66.9%。说明生防菌株添加适合的营养载体能够显著提高防效和促进增产，这可能是因为适合的营养载体使复合菌菌量大量增加，更能适应复杂的土壤微生物环境，提高复合菌在植株根际的定殖能力，占据植株根部生态位点，促进其产生抗菌物质的能力，从而达到有效抑制病害的发生。且营养载体在发酵过程中将一些不易利用的营养成分转化为易于植物吸收的小分子物质，能为植物提供更丰富的营养。谭兆赞等[34]研究结果表明，复合微生物菌剂可提高土壤微生物的多样性，降低土壤病原菌的基数，从而抑制番茄青枯病的发生。Lee等[35]比较健康番茄和患青枯病番茄根际土壤微生物多样性，结果表明番茄植株根际放线菌丰度高有利于抑制青枯病的发生，这均与本研究结果基本一致。Marian等[36]将β-变形菌 TWR114 和非致病性青枯菌TCR112按不同比例复合后，对盆栽番茄青枯病的防治效果均优于单一菌剂，可显著降低番茄根际青枯病菌的数量，其作用机理研究表明复合菌具有更强的防御和协调抑制作用，有助于提高生防效果。

本文初步研究了2株生防放线菌复合防治番茄青枯病的效果，充分利用有益菌与病原菌之间的拮抗、竞争等关系，发挥了生防菌之间的协同增效特点，降低植株根际病原菌的基数，从而降低发病率和病情指数，促进植株生长。由于本文仅测定了复合菌剂的盆栽防效，还未进行田间试验，相对较为复杂的大田土壤环境下的应用效果还有待进一步研究。