类芽胞杆菌W51菌剂制备及对番茄青枯病的防效研究

蔡傅红 ，袁志香 ，史雨琪，朱晶凤，韦 欢，丁志鹏，张弯弯，颜歆雯，刘红霞，王晓莉，王云鹏

（1．淮阴工学院生命科学与食品工程学院/江苏省益生菌制剂重点实验室，淮安 223003；2．南京农业大学植物保护学院，南京 210095）

番茄是我国重要的蔬菜作物，近年来生产规模不断扩大。由青枯劳尔氏菌R.solanacearum引起的细菌性土传病害，导致番茄产量急剧下降，造成巨大的经济损失[1]。青枯病原菌可通过雨水、灌溉、地下虫害或操作工具等方式从番茄的根部、茎基部皮孔或伤口侵入并潜伏，条件适宜时在维管束内迅速繁殖，堵塞导管使植株得不到应有的水分和营养而萎蔫死亡[2]。该病害一旦发病便难以控制，常造成番茄植株的大面积枯萎死亡，严重制约了番茄产业的发展[3,4]。

目前，对番茄青枯病的防治已有诸多报道，比如药剂灌根、作物轮种、抗性育种等，但尚无稳定有效的防治措施[5,6]。近年来，生物防治已成为一种安全可靠的病害防治方法[7,8]。利用生防菌株如无致病力青枯菌[9]、假单胞菌[10,11]、芽胞杆菌[12,13]等对番茄青枯病进行生物防治的方法已引起广大科研人员和农药公司的研究兴趣，其中芽胞杆菌是多种病原菌的拮抗菌，能预防和控制多种作物病害，被普遍认为是一种环境友好、经济有效的病害防治途径[14,15]。目前，国内外利用生防菌株防治番茄青枯病取得了一定的研究进展，但仍然缺少高效、低毒、安全的微生物制剂产品[16]。

伊利石是一种常见的黏土矿物，含有大量金属阳离子如 Fe2+、Mg2+、Si2+等[17]可以与细菌细胞壁表面的肽聚糖相结合。此外，伊利石晶体所具有的大比表面积的特征也使得其具备良好的静电吸附性能，这些特征使得伊利石在水中能够聚集细菌菌体[17,18]。但有关以粘土矿物吸附剂为载体制备的微生物制剂对番茄青枯病防治研究鲜有报道。本研究以伊利石为载体吸附生防菌从而制得微生物制剂，并用于番茄青枯病的防治，为番茄青枯病的防治提供有效措施。

1 材料与方法

1.1 伊利石

伊利石购自河南舒山伊利石矿业开发有限公司，粒度＜2 µm，Al2O3＞32%，K2O＞6%，SiO2＜54%，TiO2＋Fe2O3＜1%，自然白度＞85%。

1.2 菌株与培养条件

病原菌选用青枯劳尔氏菌ZJ3721，由南京农业大学植物保护学院提供；类芽胞杆菌W51分离自江苏省淮安市马头镇番茄种植园土壤。培养青枯劳尔氏菌ZJ3721的固体培养基为YGPA培养基[19]（葡萄糖10 g，蛋白胨5 g，酵母提取物5 g，琼脂18 g，用蒸馏水定容至1 L，调节pH至7.0）；类芽胞杆菌W51的固体培养基为LB琼脂培养基（NaCl 10 g，蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，琼脂18 g，用蒸馏水定容至1 L，调节pH至7.0）。培养青枯劳尔氏菌ZJ3721和类芽胞杆菌W51的种子液培养基为YGPB培养基（葡萄糖10 g，蛋白胨5 g，酵母提取物5 g，用蒸馏水定容至1 L，调节pH至7.0），青枯劳尔氏菌ZJ3721扩繁培养基为NB培养基（NaCl 5 g，蛋白胨10 g，牛肉浸粉5 g，用蒸馏水定容至1 L，调节pH至7.0），类芽胞杆菌W51扩繁培养基为PDB液体培养基（马铃薯浸出粉8 g，葡萄糖20 g，用蒸馏水定容至1 L，调节pH至7.0）。

1.3 类芽胞杆菌W51对青枯劳尔氏菌ZJ3721的抑菌试验

将保存在甘油管中的类芽胞杆菌W51于LB平板上活化，32 ℃培养48 h后接种至YGPB液体培养基中，32 ℃、200 r/min振荡培养24 h，用无菌PDB液体培养基将菌液稀释至1×108CFU/mL；将保存在甘油管中的青枯劳尔氏菌ZJ3721于YGPA平板上活化，35 ℃培养24 h后接种至YGPB液体培养基中，35 ℃、180 r/min振荡培养24 h，用无菌NB液体培养基将菌液稀释至1×108CFU/mL。采用平板对峙法测定拮抗菌类芽胞杆菌W51对青枯劳尔氏菌ZJ3721的抑制能力[20,21]，取100 µL青枯劳尔氏菌ZJ3721菌悬液均匀涂布在LB平板中，在LB平板上放置无菌滤纸片，加入类芽胞杆菌W51菌悬液，空白用无菌PDB液体培养基做对照，试验重复3次，35 ℃培养24 h后观察统计抑菌圈直径。

1.4 类芽胞杆菌W51的鉴定

将待测菌株接种在NB培养基中32 ℃培养24 h，以10000 g/min离心15 min收集菌体。用细菌DNA提取试剂盒（Promega，美国）提取所分离类芽胞杆菌W51的全基因组，以其为模板进行16S rDNA基因的PCR 扩增，扩增引物为细菌16S rDNA基因通用引27F (5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')和1492R(5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3')[22-24]。PCR反应体系（50 μL）：反应体系混合液25 μL，上、下游引物各2 μL，样品DNA提取液1 μL，ddH2O补足至50 μL。PCR反应条件：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃复性90 s，重复25个循环；72 ℃延伸10 min。所得PCR产物委托上海美吉生物医药科技有限公司进行测序，将16S rDNA测序结果在NCBI上进行BLAST比对，再用MEGA7.0构建系统发育树。

1.5 吸附条件筛选

1.5.1 最佳吸附配比筛选 将振荡培养24 h的类芽胞杆菌W51培养液以1:500接种至PDB液体培养基中，32 ℃、200 r/min振荡培养36 h，3500 g/min离心30 min，弃上清，沉淀用无菌水重悬至OD600＝0.8，此时菌悬液的浓度约为1×109CFU/mL。选取质量比为1%、2%、3%、4%、5%、6%的伊利石（根据前期试验结果表明所选浓度对菌体生长无影响）进行最佳吸附配比的筛选试验，使用蔗糖密度梯度法[25]测定不同比例的伊利石粉对类芽胞杆菌菌体的吸附效果。

向浓度为1×109CFU/mL的类芽胞杆菌W51菌悬液中加入上述配比的无菌伊利石，于摇床中32 ℃、200 r/min振荡培养30 min，取混合液于试管中，向其底部缓慢加入等体积的60%质量浓度的无菌蔗糖溶液，静置2 h。吸附在伊利石上的菌体会下沉至蔗糖溶液的底部，而未被吸附的菌体则继续停留在蔗糖溶液的上层，吸取上层混合液稀释涂平板，32 ℃培养12 h后计单菌落数，计算吸附率C，选取最佳吸附率的伊利石粉添加配比进行后续试验。C（%）＝（1－m/M）×100，其中m表示加入吸附剂后的混合液在蔗糖溶液上层的单菌落数，M表示未加入吸附剂的菌悬液在蔗糖溶液上层的单菌落数。

1.5.2 最佳吸附时间筛选 选取10、20、30、40、50、60 min进行最佳吸附时间的筛选试验，使用蔗糖密度梯度法测定不同比例的伊利石粉对类芽胞杆菌W51菌体的吸附效果。

向类芽胞杆菌W51菌悬液中加入已筛选出的最佳配比的无菌伊利石粉，分别于摇床中32 ℃、200 r/min振荡培养上述吸附时间，取混合液于试管中，向其底部缓慢加入等体积的60%质量浓度的无菌蔗糖溶液，静置2 h后吸取上层液体稀释涂平板，32 ℃培养12 h后计数单菌落数并按公式计算吸附率。

1.6 伊利石吸附W51菌剂的制备

将保存在甘油管中的类芽胞杆菌W51于LB平板上活化，32 ℃培养48 h后接种至YGPB液体培养基中，32 ℃、200 r/min振荡培养24 h，将类芽胞杆菌W51培养液以1:500接种至PDB液体培养基中，32 ℃、200 r/min振荡培养36 h后3500 g/min离心30 min，弃上清，沉淀用无菌水重悬至OD600＝0.8，此时菌悬液的浓度约为1×109CFU/mL，向菌悬液中加入4%的灭菌后的伊利石粉（121 ℃高压灭菌20 min），于摇床中32 ℃、200 r/min振荡培养30 min，即为所需的伊利石吸附W51菌剂。

1.7 温室防效试验

将番茄种子（品种为上海合作903）先用无菌水冲洗两遍，后用75%酒精浸泡2 min，再用无菌水冲洗3遍，消毒后的番茄种子在培养皿中催芽。72 h后选取发芽种子播种至穴盆中，当番茄苗生长至5～6片真叶时选取长势一致的苗转移至盆钵（11 cm×10 cm×8 cm）中，每盆种植1株番茄，45 d后进行试验处理。试验设3个处理：（1）空白对照组，向每盆的番茄根部灌入20 mL无菌水；（2）类芽胞杆菌W51菌悬液处理组，向每盆的番茄根部灌入20 mL类芽胞杆菌W51（浓度为1×109CFU/mL）菌悬液；（3）伊利石吸附W51菌剂处理组，向每盆的番茄根部灌入20 mL伊利石吸附W51菌剂（浓度为1×109CFU/mL）；7 d后向每盆的番茄苗灌入20 mL青枯劳尔氏菌ZJ3721（浓度为1×107CFU/mL），每个处理组有24棵番茄苗，试验重复3次。温室试验条件为35 ℃、自然光照。在10～14 d对番茄青枯病的发病情况进行统计，按照李茹等[27]、Hai等[28]报道的方法，记录分析病情指数和防效：0级，无症状；1级，1片叶枯萎；2级，2～3片叶枯萎；3级，除底部2～3片叶外，其他叶片均枯萎；4级，整株叶片枯萎；病情指数＝∑（病级数×该病级植株数）/（最高病级数×总植株数）×100，防效（%）＝（对照组病害病情指数－处理组病害病情指数）/对照组病害病情指数×100。

1.8 数据统计与分析

统计并计算吸附率、不同处理组的病情指数和防效，利用IBM SPSS Statistics 23数据分析软件进行单因素方差分析（One-way ANOVA）。数据绘图工作利用Origin 8.0完成。

2 结果与分析

2.1 类芽胞杆菌W51对青枯劳尔氏菌ZJ3721的抑菌效果

类芽胞杆菌W51对青枯菌ZJ3721有较好的抑制效果（图1），抑菌圈直径达到3.79 cm。

图1 类芽胞杆菌W51对青枯菌ZJ3721的抑制作用Fig. 1 Inhibition of Paenibacillus sp. W51 on R. solanacearum ZJ3721

2.2 类芽胞杆菌W51的基因测序分析

测序获得菌株 W51的 16S rDNA序列长度为 1436 bp，该序列在 NCBI上进行序列同源性比对（GenBank登录号：SUB9552020EDF300401MZ049605），选择同属的模式菌株利用MEGA 7.0构建了系统发育树结果表明，菌株W51与GenBank中报道的类芽胞杆菌Paenibacillussp.KCTC13919的相似性最高为99.65%（图2），初步判断菌株W51为类芽胞杆菌。

图2 类芽胞杆菌W51基于16S rDNA系统发育树Fig. 2 Phylogenetic relationships between Paenibacillus sp. W51based on the 16S rDNA

2.3 吸附条件优化

未加伊利石的菌体由于其密度低于蔗糖溶液而始终悬浮在蔗糖溶液的上层，在添加伊利石后菌体吸附在伊利石上，由于伊利石密度大，吸附在伊利石上的菌体而下沉（图3）。吸附显微观察结果发现，未加入伊利石吸附前类芽胞杆菌W51菌体呈分散状态（图3C），而加入伊利石吸附后，绝大多数类芽胞杆菌W51菌体在伊利石的附近出现聚集现象（图3D），表明伊利石具有良好吸附菌体的能力。

图3 伊利石对类芽胞杆菌W51的吸附效果Fig. 3 The adsorption effect of illite on Paenibacillus sp. W51

吸附配比筛选试验结果表明，在1%～4%的吸附剂比例下，伊利石对类芽胞杆菌W51的吸附效率显著增加，分别为（58.05±0.62）%、（78.29±1.60）%、（85.92±0.44%）和（90.39±1.29）%。当伊利石比例超过4%时，吸附率曲线趋于平稳，5%时吸附率为（90.76±1.06）%，6%时吸附率为（91.36±0.40）%，这可以解释为伊利石对类芽胞杆菌W51的吸附逐渐达到饱和（图4A）。因此，选取4%作为最佳吸附比例。

图4 最佳吸附条件筛选结果Fig. 4 Optimal adsorption conditions screening results

吸附时间筛选试验结果显示，随着吸附时间的延长，吸附率不断上升，在吸附时间为30 min 时吸附率达到峰值，为（90.78±1.36）%。随着吸附时间的延长，吸附率呈现缓慢下降趋势，在40、50和60 min时分别为（90.42±1.54）%、（90.06±1.12）%和（89.18±1.56）%（图4B）。因此，选取30 min作为最佳吸附时间。

2.4 温室防效试验

空白对照组番茄植株在青枯劳尔氏菌ZJ3721处理第9 d开始发病，至第14 d空白对照组发病最严重。接种病原菌后，试验组的番茄病情指数始终显著低于同一时期空白对照组的病情指数（P＜0.05），这表明类芽胞杆菌W51菌悬液以及伊利石吸附W51菌剂均对番茄青枯病有显著的防治效果；且伊利石吸附W51菌剂处理组的番茄病情指数始终显著低于同一时期类芽胞杆菌W51菌悬液处理组的病情指数（P＜0.05）；10～14 d时伊利石吸附W51菌剂处理组的生防效果高于类芽胞杆菌W51菌悬液处理（P＜0.05），通过伊利石吸附后的类芽胞杆菌W51菌体相较于单一类芽胞杆菌W51菌体则具有较高的生物防治效果。此外，伊利石吸附W51菌剂处理组番茄植株前期（0～9 d）无发病现象，比空白对照组延迟发病2 d，比类芽胞杆菌W51菌悬液处理组延迟发病1 d，且该处理10～14 d内对番茄青枯病的防效始终稳定在69.23%以上，显著优于类芽胞杆菌W51菌悬液处理组的42.91%（P＜0.05）（表1）。

表1 类芽胞杆菌W51和伊利石吸附W51菌剂对番茄青枯病的防治效果Table 1 The control effects of Paenibacillus sp. W51 and illite adsorption W51 agents against tomato bacterial wilt

3 讨论

番茄青枯病是番茄维管束系统性病害之一，发病严重时造成植物青枯死亡，导致严重减产甚至绝收[29]。目前国内外已有许多利用生防菌株防治番茄青枯病，从而降低青枯病侵染番茄而造成的影响，如乔俊卿等[30]筛选出的枯草芽胞杆菌Bs916对番茄进行灌根处理，可有效减轻番茄的青枯病，防效达到55.60%；王丽丽等[30]施用拮抗菌株处理3次，番茄青枯病的田间防治效果达到43%；Frey等[32]利用无致病力青枯菌进行番茄青枯病的防治，也有较好的防效。本研究主要是利用伊利石吸附类芽胞杆菌W51制得的伊利石吸附W51菌剂对番茄青枯病的防治，其防治效果达到69.23%，相对于其他单一生防菌对番茄青枯病有较高的防治效果。

许多生防菌在实际应用时显现出受环境因素影响大、防效不佳、防效时间短等问题，郭坚华等[33]认为抑菌能力强的菌株，如果在生防应用受到外界坏境条件的影响，防治效果就会不理想。近年来，随着材料科学的发展，粘土类矿物表面的物化性质不断被阐明，利用粘土矿物为载体富集菌体可以使得生防菌免受外界不良环境的影响，进而更好地发挥出生防菌株的防治潜力。伊利石是一种常见的粘土矿物，其表面带有大量的阳离子，可以与细菌细胞壁的肽聚糖相结合，吸附大量的芽胞杆菌[34]。本研究发现，将单一的类芽胞杆菌W51用于防治番茄青枯病，其生防效果为42.91%，但用伊利石吸附类芽胞杆菌W51制得的伊利石吸附W51菌剂用于番茄青枯病防治，其生防效果达到69.23%。为了保证伊利石吸附W51菌剂能够更好地发挥生防作用，还需要在今后的工作中进行防治番茄青枯病的田间试验，并进一步研究伊利石吸附W51菌剂对土壤生态坏境和田间微生物种群结构及数量的变化。本研究开发的伊利石吸附 W51菌剂可以为以后的研究工作提供参考。