发酵食品中乳酸菌的健康功效研究进展

孙钰薇,张诗瑶,刘志佳,胡小松,2,易俊洁*

1(昆明理工大学 食品科学与工程学院,云南 昆明,650500) 2(中国农业大学 食品科学与营养工程学院,北京,100083)

传统发酵食品作为人类饮食的重要组成部分,已有8000多年历史,占世界食品消费量的近1/3。2018年,我国传统发酵食品产业总产值超过1.5万亿元,约占食品工业总产值的11%,国内生产总值的1.6%[1]。发酵食品种类繁多,包括发酵乳制品、发酵豆制品、发酵蔬菜制品、发酵果品、发酵肉制品等。发酵不仅能够改善原料的风味、质地和功能特性,还是保存食物的有效方法之一,主要通过微生物代谢产生有机酸、醇、细菌素等抗菌物质,抑制致病和腐败微生物生长,提高食品的安全性和稳定性。

2001年,联合国粮食及农业组织(Food and Agriculture Organization of the United Nations,FAO)和世界卫生组织(World Health Organization,WHO)对益生菌的定义为：活的微生物,当摄入充足的数量时,它会给宿主带来某种健康益处,包括抑制有害微生物生长,提升抗氧化水平,降低血清胆固醇,调节免疫系统,抑制肠道炎症,调节肠道菌群,协同消化,预防治疗癌症等[2]。目前,益生菌主要分为乳酸菌、益生芽胞杆菌、酵母菌、双歧杆菌、丁酸梭菌等。

乳酸菌作为益生菌的重要组成,具有突出的益生特性和发酵活性,广泛应用于发酵食品的生产,如乳制品、肉类、蔬菜和烘焙产品等。从发酵食品中分离出的众多乳酸菌菌株已被证明对人类健康有益,并具有作为益生菌的潜力。可见,将乳酸菌应用于发酵食品中,不仅可以改善食品的感官营养品质、产生有机酸、降低食品pH、抑制有害菌的生长,还能促进食品原料产生酚类、氨基酸、多肽等物质[3]。基于此,本综述讨论了乳酸菌的分类和功能评价方法,以及发酵食品中乳酸菌的健康功效和作用机理,以期为开发新型功能性发酵食品提供理论基础。

1 乳酸菌的分类及应用条件

1.1 乳酸菌的分类

乳酸菌是一类能利用碳水化合物产生大量乳酸的细菌的统称。这类细菌在自然界分布广泛,至少包含39属、653个种。人们熟知的乳酸菌主要隶属于乳杆菌属、链球菌属、肠球菌属、乳球菌属、双歧杆菌属和明串珠菌属等少数属种,其中,绝大部分的菌株存在于人体的肠道当中,具有重要的生理功能。从食品应用的角度来说,乳酸菌菌株亟待开发。根据国家卫生健康委员会发布的《可用于食品的菌种名单》公告,目前乳酸菌在食品行业应用最多的为乳杆菌属(表1),包括干酪乳杆菌、发酵乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、植物乳杆菌等。用于婴幼儿食品的乳酸菌对安全性有更高的要求,包括嗜酸乳杆菌NCFM、动物双歧杆菌Bb-12、乳双歧杆菌HN019和Bi-07、鼠李糖乳杆菌LGG和HN001。

表1 可用于食品的乳酸菌菌种Table 1 Lactic acid bacteria strains that can be used in food

1.2 乳酸菌的应用条件

发酵食品是微生物的丰富来源,许多来自传统发酵食品的乳酸菌都具有益生特性。但是,并非所有乳酸菌都可于食品的生产。用于食品或保健品生产的乳酸菌,除了具备良好的益生功效外,还应具有极高的稳定性和安全性。根据FAO和WHO规定,来源于健康人胃肠道的乳酸菌可作为益生菌用于人类。此外,乳酸菌需要耐胃酸、耐胆盐,能通过人体消化道环境存活；具有肠道黏膜上皮细胞的黏附能力,进入肠道后定殖并迅速生长繁殖；必须通过动物进行急性、亚急性毒性试验等,证明无致病性、不产生生物胺等有害物质；对多数抗生素敏感,无溶血活性[4]等。

2 乳酸菌的功能评价方法

对筛选得到的乳酸菌进行功能评价是开发益生乳酸菌资源的关键步骤。其评价方法主要包括体外评价方法、模型动物体内评价和临床应用效果评价。体外评价方法速度快、成本低,是对乳酸菌益生功能初步筛选的有效手段,而动物体内评价和临床效果评价耗时长、花费高,但结果较可靠。

表2列举了部分筛选自发酵食品的乳酸菌功能评价方法,主要包括体外筛选培养基培养、胃肠道模拟体系培养、体外Caco-2细胞黏附实验、特征酶活性检测、体外抗菌实验、临床试验等方法。通过这些评价方法,可快速检测乳酸菌在胃肠道定殖能力及其降胆固醇、降血压、抗菌等方面的功能特性。此外,全基因组测序技术也常用于乳酸菌功能特性评价。通过对乳酸菌的全基因组进行测序、组装和注释,将菌株全基因组序列与现有数据库中数据进行匹配和对比,不仅可以基于基因分型精准鉴定乳酸菌至株水平,还可以检测待测菌株是否含有毒素/功效成份合成关键基因或基因簇,从而预测乳酸菌安全性和功能特性[5]。

表2 乳酸菌及功能评价方法示例Table 2 Examples of functional evaluation of lactic acid bacteria

乳酸菌功能特性的体外评价方法主要以昆虫或动物为宿主,构建实验模型,经喂食乳酸菌活菌,再与空白组进行对比,验证待测菌功能特性。目前常用于体内乳酸菌功能特性验证的模型生物包括蜜蜂、果蝇、小鼠等。同时,乳酸菌在各种疾病中的临床应用也较为广泛,用于治疗腹泻、细菌性阴道炎、糖尿病、肝硬化等。国内外均有报道关于乳酸菌治疗这些疾病的临床试验报告,证实具有良好的疗效,使得乳酸菌制剂产业具有广阔的前景。例如,针对素食和乳糖不耐受消费者的植物基乳酸菌制剂和针对糖尿病、高血压、高血脂患者开发具有血糖调节、血压调节、脂质代谢调节功能的乳酸菌制剂等。然而由于种属和体型差异,模型生物所得的结果常常与人体临床实验结果差异较大,且缺乏更加广泛的多中心临床研究。因此,建立快捷、可靠的功能评价体系是开发乳酸菌资源的重要途径。

3 乳酸菌的健康功效及作用机理

3.1 抗菌活性

目前,食源性疾病仍然给世界带来了巨大的公共卫生、经济和社会负担。将近70%的食源性危害是由腹泻病原体造成的,如沙门氏菌,肠道致病性、产毒性大肠杆菌,李斯特菌等。研究发现,很多来源于发酵食品的乳酸菌具有抑菌功效,除了可用于食物保藏,还可以用于食源性疾病的防治,改善肠道微生物环境。

乳酸菌的抑菌活性主要通过两方面的作用。一方面,乳酸菌可产生抗菌物质,抑制病原菌的生长。如表3所示,植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、短乳杆菌等乳杆菌具有抗大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、鼠伤寒沙门氏菌等食源性致病菌的活性。这些乳酸菌进入人或动物体内黏附于肠道上皮细胞后,迅速繁殖形成菌膜,与病原菌、有害微生物争夺定殖位点及营养,分泌抑菌活性物质(细菌素、乳酸和有毒的氧代谢物)[13]。其中,细菌素(如乳酸链球菌素、Helveticin J、乳杆菌素等)是一类具有抑菌活性的多肽或前体多肽,能够对一些食源性病原体和引起腐败的细菌表现出广泛的抗菌活性。

另一方面,一些乳酸菌菌株亦可通过影响病原菌毒力相关基因的表达,或酶与抗菌肽段残基通过盐桥、氢键和金属相互作用而达到抑菌的效果[14]。例如,从发酵西红柿泡菜中筛选得到的植物乳杆菌200661能够通过下调变形链球菌葡聚糖形成相关基因(gtfA,gtfB和gtfD)表达,进而破坏变形链球菌不溶性葡聚糖的合成,从而减少病原菌生物膜的形成[14]。

表3 具有抗菌活性的部分乳酸菌Table 3 Some lactic acid bacteria with antibacterial activity

3.2 抗氧化活性

基于对乳酸菌益生特性的研究发现,发酵食品中许多乳酸菌在动物机体中可发挥抗氧化活性(表4),主要包括植物乳杆菌、短乳杆菌、发酵乳杆菌、鼠李糖乳杆菌等。这些菌株由于抗氧化体系的差异,它们对自由基防御能力的机制不同,通常包括清除自由基、提高金属离子螯合活性、调节酶活性、增加多酚物质含量等[21-23]。例如,从新疆传统发酵酸奶中筛选得到的1株植物乳杆菌KFY02,能上调肝损伤小鼠体内超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的表达,有效增强机体的抗氧化能力[23]；从韩国传统泡菜中分离得的植物乳杆菌KCTC 3099活菌和胞外提取物能够螯合铁离子和铜离子,减少羟基自由基的产生[21]。

表4 具有抗氧化活性的部分乳酸菌Table 4 Some lactic acid bacteria with antioxidant activity

3.3 免疫调节功能

免疫系统是由细胞、组织和器官组成的复杂网络,他们共同起作用,以保护人体免受有害物质和生物的侵害并防御疾病。免疫系统能够保持免疫稳态,刺激机体分泌多种免疫因子,如干扰素、白细胞介素、肿瘤坏死因子等[29]。目前,免疫调节剂在对抗疾病方面起着重要的作用,对诱发宿主保护性免疫反应十分有效。乳酸菌是肠道微生态中的优势菌群,其细胞表面碳水化合物、修饰脂磷壁酸结构的酶和代谢物都可调节免疫系统的功能[30]。

发酵食品中的许多乳酸菌都有免疫调节功能(表5),主要通过3个途径来增强机体免疫：(1)增强机体的非特异性免疫功能,通过提高宿主自然杀伤细胞、巨噬细胞和吞噬细胞的活力,促进部分淋巴细胞分泌IL-6、IFN-γ、IgA等,或是与CD4+T细胞互作,影响CD4+T分化为Th17、Th2、Treg等细胞。例如,从泡菜中筛选的1株戊糖乳杆菌S-PT84可显著增强小鼠脾细胞自然杀伤活性[31]；(2)刺激机体的细胞免疫和体液免疫,调节机体IL-4、IL-8、INF-α的表达。例如,从泡菜中分离的魏斯氏乳杆菌JW15能促进免疫细胞分泌各种细胞因子(TNF-α、IFN-γ、IL-6、IL-4等)[32]；(3)调节T淋巴细胞和B淋巴细胞,下调促炎因子IL-12、IL-17、IL-23等的表达,加强免疫球蛋白(IgA、IgG等)的水平。例如,分离自发酵玫瑰汁的一株植物乳杆菌YYC-3喂食高脂肪饮食的小鼠,能够降低小鼠体内炎症细胞因子IL-6、IL-17F和IL-22的表达,减少炎症细胞的浸润[33]；(4)乳酸菌还可通过释放多种生物活性因子(肽、游离胞外多糖、游离氨基酸、有机酸和维生素),提高宿主机体免疫力。例如,从泡菜中分离的肠膜明串珠菌能够产生胞外多糖,该物质显著抑制脂多糖刺激的小鼠巨噬细胞中促炎细胞因子IL-6的分泌[34]。

表5 具有免疫功能的部分乳酸菌及其调节机制Table 5 Some lactic acid bacteria with immune function and its regulation mechanism

3.4 降低胆固醇

胆固醇为哺乳动物细胞膜的必需成分,具有维持细胞膜的流动性和完整性的作用。然而,过多的胆固醇会导致心血管和其他动脉粥样硬化疾病。研究表明,功能性食品和营养制品、膳食纤维、益生菌(如乳杆菌、双歧杆菌等)预防和控制高胆固醇对人体造成的危害[36]。

国内外许多研究通过体外试验、动物试验等探究乳酸菌对胆固醇的降解效果及机理,提出了乳酸菌降解胆固醇的两种理论(图1)：(1)同化吸收理论。乳酸菌可以将胆固醇吸收进入菌体细胞或吸附于细胞膜,降低机体胆固醇的含量；(2)共沉淀理论。乳酸菌可产生胆盐水解酶,使胆固醇与游离胆盐结合生成胆汁酸,机体无法吸收胆汁酸,从而降低机体胆固醇的含量[37]。目前,许多研究已证明发酵食品中分离出的乳酸菌具有良好的胆固醇降解效果。

图1 乳酸菌降胆固醇机制Fig.1 The cholesterol-lowering mechanism of lactic acid bacteria

3.5 调节脂代谢

肥胖作为一种全球流行病,是一种复杂的代谢紊乱,会导致慢性疾病发病风险增加,如心血管疾病、肾病、糖尿病、高血压、高胆固醇等。肥胖及其并发症与脂代谢紊乱和肠道微生物群结构、功能和多样性改变有关[38]。乳酸菌对脂代谢调节,既可以通过乳酸菌本身调节宿主脂代谢,也可以通过发酵,促使食品中的成分结构改变起到减肥效果。研究表明,植物乳杆菌发酵胡萝卜浆的多糖分子量减少,而酸溶性和碱溶性多糖的分子量增加,使发酵胡萝卜汁具有较强的·OH清除活性,·OH的清除可调节血糖代谢,有益于糖尿病的控制,能够预防肥胖[39]。表6列举了已通过动物试验证明,发酵食品中具有抗脂肪作用的乳杆菌(植物乳杆菌、清酒乳杆菌、短乳杆菌、弯曲乳杆菌等)。利用这些菌株干预高脂饮食诱导的肥胖小鼠的日常膳食,可以改善肠道菌群结构、维持肠道屏障完整性、降低肠道通透性、干扰脂质吸收、影响脂肪细胞因子表达、产生脂肪酸、调节胆汁酸代谢等。例如,从自然发酵酸奶中筛选得到的植物乳杆菌KFY02能够使肥胖小鼠白色脂肪组织中的脂肪酸合成酶的表达显著增加,减少其脂肪细胞膨胀体积[40]。

表6 乳酸菌调节脂代谢的相关试验Table 6 Related tests of lactic acid bacteria regulating lipid metabolism

3.6 抗癌/抗肿瘤

生物疗法是一种通过生物制剂增强免疫系统,从而对抗癌症的治疗方法。乳酸菌能够干扰与癌症相关的信号通路,减轻由药物治疗带来的副作用,可作为一种生物疗法载体应用于癌症的预防和治疗。如图2所示,乳酸菌抗癌机制主要有:(1)抑制致癌作用酶(如β-葡萄苷酸酶、硝基还原酶和偶氮还原酶等)的产生以及癌细胞的增殖；(2)改变肠道菌群结构组成,进而影响肠粘膜特性(黏蛋白的降解速度、更新速度等),促进受损上皮细胞的修复并增强上皮细胞的紧密连接,起到对肠道粘膜屏障的保护作用；(3)产生抗炎因子,例如TGF-β、IL-10等,调节免疫系统进而激活免疫细胞(肿瘤坏死因子、白细胞介素、干扰素等)对抗肿瘤；(4)产生抗癌细胞增殖物质,如功能性糖肽[45]。

图2 乳酸菌抗癌机制Fig.2 Anti-tumor mechanism of lactic acid bacteria

结直肠癌是常见的恶性肿瘤,近年来其发病率和致死率持续上升。乳酸菌可以在结直肠癌的预防和治疗方面发挥重要作用。体外试验证明,源于发酵植物和发酵乳的乳酸菌的乳酸脱氢酶活性较高,可下调原癌基因编码的细胞膜受体(如ErbB-2 和 ErbB-3)的表达,抑制了人结肠癌细胞HT-29和Caco-2的生长[46]。随着研究不断深入,亦有通过动物模型阐释抑制结肠癌及其他癌症可能机制。例如,从发酵玫瑰汁分离了1株植物乳杆菌能显著改变小鼠结肠组织微环境,减少炎症细胞因子(IL-6、IL-17F、IL-22等)表达,预防小鼠黏膜损伤和结肠肿瘤的发生[33]。

3.7 降血压

高血压是一种流行的慢性非传染性疾病,是引起心血管、肾脏和脑血管疾病的重要因素。导致高血压的因素包括衰老、肥胖、高钠低钾的饮食,它是环境、遗传、行为和内分泌因素之间相互作用的结果,通常伴有糖和脂肪代谢紊乱、肾脏系统功能障碍和性激素失衡等[47]。

乳酸菌可通过影响机体氧化应激、血管紧张素系统、炎症、内皮素和过氧亚硝酸盐的产生来影响血压(图3)[46]。摄入含有乳酸菌的功能性食品和乳酸菌补充剂被证明能够降低人群的高血压患病率。降血压的机理主要包括：(1)乳酸菌通过其胞外酶水解底物蛋白特定的蛋白组,产生血管紧张素转换酶抑制(angiotensin converting enzyme inhibition,ACEI)肽、γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)。例如,利用瑞士乳杆菌发酵牛奶的过程中,ACEI肽可从牛乳酪蛋白中释放出来,所得发酵乳具有降低动脉血压的功效[48]；牛奶发酵及蛋白质水解过程中,由于它们所含的天然酪蛋白含有L-谷氨酸,一些乳酸菌可利用该物质,经谷氨酸脱羧酶的作用合成GABA,GABA能够显著诱导人皮肤局部防御系统的动态组成部分HBD-2基因的表达,且具有潜在的降压作用[49]。(2)乳酸菌菌体成分,主要有细胞壁成分和细胞自溶后的裂解物,其中,ACEI肽是抑制高血压的重要物质。例如,分离自传统干酪的植物乳杆菌产生的ACE抑制肽能够在较宽范围的pH值(2～12)和温度条件(20～60 ℃)下,保持良好稳定,且对糜蛋白酶、胃蛋白酶和胰蛋白酶也表现出良好稳定性,用该肽提取物长期灌胃大鼠,对高血压显示良好的治疗效果[50]。

TNF-肿瘤坏死因子；IL-白细胞介素；MCP-单核细胞趋化因子；ET-内皮素；NADPH-烟酰腺嘌呤二核苷酸；ROS-活性氧；TLR-toll样受体；ACE-血管紧张素转换酶；NOS-一氧化氮合酶；NO-一氧化氮图3 乳酸菌降血压机制[46]Fig.3 The blood pressure-lowering mechanism of lactic acid bacteria注：乳酸菌可通过影响氧化应激、血管紧张素系统、炎症、ET和过氧亚硝酸盐的产生来影响血压。NADPH氧化酶活性可以通过ROS介导的TLR4激活内皮功能；NOS可以通过调节NO合成来影响内皮功能。AT1受体和ACE可以影响血管紧张素Ⅱ。

4 总结与展望

大量试验结果表明,乳酸菌能够调节免疫功能、降低胆固醇、促进消化、预防癌症等,将乳酸菌纳入饮食,能够带来健康益处。但是,对于乳酸菌的潜在毒性大多是临床前研究,往往导致许多乳酸菌的人体临床结果与临床前结果存在较大差别或相互矛盾。因此,未来的研究应更注重乳酸菌在人体内的安全性评价,完善乳酸菌安全性评价体系。此外,为了进一步确定乳酸菌在人体内的功效,还应该区分动物模型试验和人体试验的差别,强调人体临床试验的重要性。针对特定人群、特定环境、特定疾病,开发精准乳酸菌产品,阐释乳酸菌的效应机制,确定乳酸菌的安全性、可靠性及潜在副作用等,将成为未来乳酸菌产业发展的主要趋势。