槲皮素对人宫颈鳞癌顺铂耐药细胞 SiHa/DDP的逆转作用研究

冯磊 杨建敏 杨然 孙丽 董莉丽 张清伟

中图分类号 R965 文献标志码 A 文章编号 1001-0408（2021）23-2875-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2021.23.10

摘 要 目的：研究槲皮素对人宫颈鳞癌顺铂耐药细胞SiHa/DDP的逆转作用。方法：测定顺铂对SiHa/DDP细胞的耐药指数以及槲皮素对SiHa/DDP细胞的逆转耐药倍数;考察槲皮素（0.005 μg/mL）、顺铂（2.5 μg/mL）、顺铂联合槲皮素（2.5 μg/mL顺铂+0.005    μg/mL槲皮素）、槲皮素联合通路抑制剂（0.005 μg/mL槲皮素+20 nmol/L雷帕霉素）对SiHa/DDP细胞凋亡率及磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信号通路相关蛋白[PI3K、Akt、mTOR、肿瘤多药耐药蛋白（P-gp）、p70核糖体S6激酶（p70S6K）]表达的影响。结果：顺铂对SiHa/DDP细胞的耐药指数为5.19，槲皮素对SiHa/DDP细胞的逆转耐药倍数为4.00。与单用顺铂和单用槲皮素比较，顺铂联合槲皮素、槲皮素联合雷帕霉素均可显著升高SiHa/DDP细胞的凋亡率（P<0.05），显著降低Akt、mTOR、p70S6K蛋白的磷酸化水平和P-gp蛋白的表達水平（P<0.05）。结论：槲皮素可逆转SiHa/DDP细胞对顺铂的耐药性，其作用机制可能与抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路相关蛋白的表达有关。

关键词 槲皮素;宫颈鳞癌;SiHa/DDP细胞;PI3K/Akt/mTOR信号通路;耐药性;逆转

Study on Reversal Effect of Quercetin on Human Cervical Squamous Carcinoma Cisplatin-resistant Cell Line SiHa/DDP

FENG Lei1，YANG Jianmin1，YANG Ran1，SUN Li1，DONG Lili1，ZHANG Qingwei2（1. Dept. of Gynaecology， Nanyang Municipal Central Hospital， Henan Nanyang 473000， China; 2. Dept. of Gynaecology， the First Affiliated Hospital of Luohe Medical College， Henan Luohe 462000， China）

ABSTRACT   OBJECTIVE： To study the reversal effect of quercetin on human cervical squamous carcinoma cisplatin-resistant cell line SiHa/DDP. METHODS： The drug resistance index of cisplatin to SiHa/DDP cells， and the reversal resistance multiple of quercetin to SiHa/DDP cells were determined. The effects of quercetin （0.005 μg/mL）， cisplatin （2.5 μg/mL）， cisplatin combined with quercetin （2.5 μg/mL cisplatin+0.005 μg/mL quercetin）， quercetin combined with pathway inhibitor （0.005 μg/mL quercetin+20 nmol/L rapamycin） on the apoptotic rate of SiHa/DDP cells were investigated， as well as its effects on the expression of phosphatidylinositol 3-kinase （PI3K）/protein kinase B（Akt）/mammalian rapamycin target protein （mTOR） signaling pathway related proteins （PI3K， Akt， mTOR， P-gp， p70S6K）. RESULTS： The resistance index of cisplatin to SiHa/DDP cells was 5.19， and reversal resistance multiple of quercetin to SiHa/DDP cells was 4.00. Compared with cisplatin alone and quercetin alone， cisplatin combined with quercetin， quercetin combined with rapamycin could significantly increase the apoptotic rate of SiHa/DDP cells （P<0.05）， while decreased the phosphorylation of Akt， mTOR and p70S6K protein as well as the expression of P-gp protein （P<0.05）. CONCLUSIONS： Quercetin can effectively reverse drug resistance of SiHa/DDP cells to cisplatin， which may be associated with inhibiting the expression of the protein related to PI3K/Akt/mTOR signaling pathway.

KEYWORDS   Quercetin; Cervical squamous carcinoma; SiHa/DDP cells; PI3K/Akt/mTOR signaling pathway; Drug resistance; Reversal

宫颈癌是较常见的恶性腫瘤之一，其发生、发展与人乳头瘤病毒（HPV）密切相关;在宫颈癌的病理分类中，宫颈鳞癌是最主要的类型，约占80%[1]。有研究提示，以顺铂为基础的辅助化疗对宫颈鳞癌的副作用小、疗效确切，可改善患者局部病灶，提高患者生存率;但顺铂易产生耐药性，降低肿瘤化疗的效果[2]。相关研究发现，在多数耐药肿瘤细胞中磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信号通路常处于异常激活的状态[3]。PI3K/Akt/mTOR信 号通路相关蛋白是调控细胞增殖及分裂的关键信号分子，可影响肿瘤多药耐药蛋白（P-gp）、p70核糖体S6激酶（p70S6K）等蛋白的表达，从而激活肿瘤细胞的耐药作用[4-5]。

槲皮素是黄酮类化合物，对多种恶性肿瘤均具有抑制作用，可促进肿瘤细胞凋亡，抑制其迁移和侵袭，同时还可增加肿瘤细胞对化疗的敏感性[3]。但槲皮素是否可逆转宫颈癌细胞的耐药性，尚不明确。为此，本研究基于PI3K/Akt/mTOR信号通路探讨槲皮素对人宫颈鳞癌顺铂耐药细胞 SiHa/DDP的逆转作用，以期为宫颈癌的临床治疗提供新的思路。

1 材料

1.1 主要仪器

本研究所用MR-96A型自动酶标仪购自深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司，CytoFLEX型流式细胞仪购自美国Beckman Coulter公司，DGENETM型自动电泳凝胶成像分析仪购自日本Olympus公司，CCL-170B-8型细胞培养箱购自上海必宝生物科技有限公司。

1.2 主要药品与试剂

本研究所用DMEM 培养基、胎牛血清（批号分别为17M483、1967839）购自美国Gibco公司;青霉素-链霉素溶液、CCK-8试剂、AnnexinⅤ-FITC 细胞凋亡检测试剂盒、BCA蛋白浓度测定试剂盒（批号分别为1936917、C0038、C1062L、P0012）均购自上海碧云天生物技术有限公司;顺铂（批号H37021358）购自山东齐鲁制药有限公司;槲皮素、兔抗小鼠Akt单克隆抗体、兔抗小鼠磷酸化Akt（p-Akt）单克隆抗体、兔抗小鼠mTOR 单克隆抗体、兔抗小鼠磷酸化mTOR（p-mTOR）单克隆抗体（批号分别为Q4951、SAB4500796、SAB4504331、SAB4501038、SAB4504476） 均购自美国Sigma公司;兔抗小鼠p70S6K单克隆抗体、兔抗小鼠P-pg单克隆抗体、兔抗小鼠GAPDH单克隆抗体（批号分别为14485-1-AP、2236-1-AP、16825-1-AP）均购自美国Proteintech公司;兔抗小鼠磷酸化p70S6K（p-p70S6K）多克隆抗体（批号RS-2602R）购自美国Cell Signaling公司;辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗兔免疫球蛋白G（二抗）（批号20000258）购自美国CST公司;高效ECL显色试剂（批号1515601）购自美国Millipore公司;雷帕霉素（批号H12J10J79598，纯度99%）购自上海源叶生物科技有限公司;其余试剂为实验室常用规格，水为纯净水。

1.3 细胞

人宫颈鳞癌细胞SiHa 购自中国科学院上海生科院细胞资源中心，人宫颈鳞癌顺铂耐药细胞 SiHa /DDP购自湖南丰晖生物科技有限公司。

2 方法

2.1 细胞培养

将SiHa细胞和SiHa/DDP细胞以含有10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素的DMEM培养基（以下简称“完全培养基”），于37 ℃、5%CO2的培养箱中进行常规培养。在细胞状态良好、融合度达80%～90%时，以磷酸盐缓冲液（PBS）清洗后，进行传代。取对数生长期细胞进行后续实验。

2.2 SiHa/DDP细胞的耐药指数检测

采用CCK-8法进行检测。取对数生长期的SiHa细胞和SiHa/DDP细胞，按2×105 mL-1接种于96孔板中，每孔100 μL，常规培养12 h后，将细胞分为对照组和不同浓度顺铂组（顺铂终质量浓度分别为 0.625、1.25、2.5、5、7.5 μg/mL，参考文献[6]设置），每组设5个复孔。对照组加入完全培养基200 μL，不同浓度顺铂组加入含相应质量浓度顺铂的完全培养基100 μL，常规培养24 h;弃去培养基，每孔加入CCK-8 试剂10 μL，于室温孵育2 h后，采用酶标仪于450 nm 波长处检测各孔光密度（OD）值。计算细胞抑制率[细胞抑制率=（对照组OD值-给药组OD值）/对照组OD值×100%]和顺铂的半抑制浓度（IC50），再在此基础上计算SiHa/DDP细胞的耐药指数（耐药指数=SiHa/DDP细胞的IC50/SiHa细胞的IC50]。

2.3 槲皮素对SiHa/DDP细胞的耐药逆转作用考察

2.3.1 槲皮素对SiHa细胞、SiHa/DDP细胞的抑制作用考察 采用CCK-8法进行考察。取对数生长期的SiHa细胞和SiHa/DDP细胞，按2×105 mL-1接种于96孔板中，每孔100 μL，常规培养12 h后，将两种细胞均分别分为对照组、不同浓度槲皮素组（槲皮素的终质量浓度分别为 0.005、0.01、0.025、0.05、0.075、0.1、0.125、0.15 μg/mL，参考文献[6]设置），每组设5个复孔。对照组加入200 μL完全培养基，不同浓度槲皮素组加入含相应质量浓度槲皮素的完全培养基100 μL，常规培养24 h;弃去培养基，每孔加入CCK-8试剂10 μL，于室温孵育2 h后，采用酶标仪于450 nm 波长处检测各孔OD值，按“2.2”项下方法计算槲皮素对SiHa、SiHa/DDP细胞的抑制率。

2.3.2 槲皮素对SiHa/DDP细胞的逆转耐药倍数检测 采用CCK-8法进行检测。取对数生长期的SiHa/DDP细胞，按2×105 mL-1接种于96孔板中，每孔100 μL，常规培养12 h后，将细胞分为对照组、不同浓度顺铂组、顺铂+不同浓度槲皮素组，每组设5个复孔。对照组加入完全培养基200 μL，不同浓度顺铂组加入含顺铂的完全培养基100 μL（顺铂终质量浓度分别为0.625、1.25、2.5、5、7.5 μg/mL），顺铂+不同浓度槲皮素组加入含顺铂和槲皮素的完全培养基100 μL（固定顺铂的终质量浓度为 2.5  μg/mL，槲皮素的终质量浓度分别为0.005、0.01、0.025、0.05、0.075、0.1、0.125、0.15 μg/mL，参考“2.2”项下结果以及预实验结果设置），常规培养24 h;弃去培养基，每孔加入CCK-8试剂10 μL，于室温孵育2 h后，采用酶标仪于450 nm 波长处检测各孔OD值，按“2.2”项下方法计算细胞抑制率和药物的IC50，并计算槲皮素对SiHa/DDP细胞的逆转耐药倍数[逆转耐药倍数=顺铂组的IC50/（顺铂+不同浓度槲皮素组的IC50）][7-8]。

2.4 槲皮素对SiHa/DDP细胞凋亡率的影响考察

取对数生长期的SiHa/DDP细胞，按2×105 mL-1接种于96孔板中，每孔100 μL，常规培养12 h后，将细胞分为对照组、槲皮素组（0.005 μg/mL）、顺铂组（2.5 μg/mL）、顺铂+槲皮素组（2.5 μg/mL顺铂+0.005 μg/mL槲皮素）、槲皮素+通路抑制剂组（0.005 μg/mL槲皮素+20 nmol/L雷帕霉素），每组设5个复孔。各组给药浓度参考预实验结果设置。对照组加入完全培养基200 μL，各给药组加入含相应药物的完全培养基200 μL，常规培养24 h;收集细胞，以4 ℃的PBS洗涤2次，并调整细胞密度为1×105 mL-1，以1 000 r/min 离心5 min;弃上清液，下层细胞加入Annexin Ⅴ-FITC结合液重悬;取细胞悬液100 μL，加入Annexin Ⅴ-FITC试剂5 μL以及碘化吡啶10 μL，于室温避光孵育15 min后，加入PBS至500 μL，采用流式细胞仪检测各组细胞凋亡率。

2.5 槲皮素对SiHa/DDP细胞中Akt、mTOR、p70S6K、P-gp蛋白表达的影响考察

采用Western bolt法进行考察。取对数生长期的SiHa/DDP细胞，按2×105 mL-1接种于96孔板中，每孔100 μL，常规培养12 h后，按“2.4”项下方法分组、给药和培养，每组设3个复孔。收集细胞，加入含蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液于冰上裂解30 min，以12 000 r/min离心10 min 后收集总蛋白，采用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度。将蛋白煮沸10 min进行变性，然后取50 μg变性蛋白，进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳;转膜，以5%脱脂奶粉封闭1 h，分别加入 Akt（稀释度为1 ∶   1 000）、p-Akt（稀释度为1 ∶ 1 000）、 mTOR（稀释度为 1 ∶ 1 000）、p-mTOR（稀释度为1 ∶ 1 000）、p-p70S6K（稀释度为1 ∶ 1 000）、p70S6K（稀释度为1 ∶ 2 000）、P-gp（稀释度为1 ∶ 1 000）、GAPDH （稀释度为1 ∶ 2 000）一抗，于4 ℃下孵育过夜;以PBST缓冲液洗涤10 min×3次，加入相应二抗（稀释度为1 ∶ 1 000），于室温孵育 2 h;以PBST缓冲液洗涤10 min×3次，加入ECL显色试剂显色，置于凝胶成像分析仪中成像。采用Image J v1.7.0软件分析，以p-Akt与Akt、p-mTOR与mTOR、p-p70S6K与p70S6K的灰度值比值分别表示Akt、mTOR、p70S6K的蛋白磷酸化水平，以P-gp与内参GAPDH的灰度值比值表示P-gp蛋白的表达水平。

2.6 统计学方法

采用SPSS 22.0 软件进行统计学分析。数据以x±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD检验。检验水准α=0.05。

3 结果

3.1 SiHa/DDP细胞的耐药指数

顺铂对SiHa/DDP细胞的IC50为14.81 μg/mL，显著高于其对SiHa细胞的IC50（2.86 μg/mL，P<0.01）;SiHa/DDP细胞的耐药指数为5.19。

3.2 槲皮素对SiHa/DDP細胞的耐药逆转作用

不同浓度的槲皮素对SiHa细胞和SiHa/DDP细胞均具有抑制作用，且细胞抑制率随着槲皮素浓度的增加呈逐渐升高的趋势。另外，与同一剂量作用于SiHa细胞比较，槲皮素（0.005～0.025 μg/mL除外）对SiHa/DDP细胞的抑制作用显著增强（P<0.05或 P<0.01），结果见表1。另经计算，顺铂联合槲皮素对SiHa/DDP细胞的IC50为3.71 μg/mL，槲皮素的逆转耐药倍数为4.00。

3.3 槲皮素对SiHa/DDP细胞凋亡的影响

与对照组比较，槲皮素组、顺铂组、顺铂+槲皮素组、槲皮素+通路抑制剂组的细胞凋亡率均显著升高（P<0.05）;与槲皮素组和顺铂组分别比较，顺铂+槲皮素组、槲皮素+通路抑制剂组的细胞凋亡率均显著升高（P<0.05）。结果见图1、表2。

3.4 槲皮素对SiHa/DDP细胞中Akt、mTOR、p70S6K、P-gp蛋白表达的影响

与对照组比较，槲皮素组细胞中Akt、mTOR、p70S6K、P-gp蛋白的表达水平均显著降低（P<0.05）;与槲皮素组和顺铂组分别比较，顺铂+槲皮素组、槲皮素+通路抑制剂组细胞中上述蛋白的表达水平均显著降低（P<0.05）。结果见图2、表3。

4 讨论

宫颈癌是世界范围内对女性影响最大的常见恶性肿瘤之一，严重影响女性生命健康和生活质量。在宫颈癌患者群体中，约13%的患者在疾病晚期才得到诊断，从而大大降低了患者生存率[9]。顺铂作为治疗宫颈癌最常用的治疗药物之一，在临床上得到了广泛的应用，然而耐药性却严重影响其治疗质量[10]。宫颈癌细胞可以通过很多途径对顺铂产生耐药，例如降低顺铂的摄入并增加外排，对抗顺铂对DNA的损伤作用以及抑制细胞凋亡信号通路等[11]。相关研究发现，天然药物中的成分不仅可以单独产生抗肿瘤作用，还可与顺铂产生协同作用，逆转肿瘤细胞对顺铂产生的耐药作用：黄芪多糖和顺铂联用可降低肺癌细胞对顺铂的耐药性[12];柚皮苷和顺铂联用可大大提高顺铂对耐药A549/DDP细胞株的抑制作用[13]。因此，联合用药为解决顺铂耐药性的问题提供了新的思路。

刘玉琼[14]研究发现，青蒿素能通过抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路的活性，抑制宫颈癌细胞的扩散;王书惠等[15]研究发现，紫草素能通过抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路活性，诱导宫颈癌细胞的凋亡和自噬，从而抑制宫颈癌细胞增殖。由此可知，PI3K/Akt/mTOR信号通路对宫颈癌的发生、发展具有重要影响。

有研究发现，槲皮素可通过多条信号通路抑制宫颈癌细胞的增殖，并促进其凋亡[16-19];还能大大降低乳腺癌MCF-7细胞对阿霉素的耐药性，并抑制耐药相关蛋白的活性[20-21]。但目前关于槲皮素逆转宫颈癌耐药方面的研究较少。基于此，本研究探讨了槲皮素对人宫颈鳞癌顺铂耐药细胞 SiHa/DDP的逆转作用。结果显示，槲皮素对SiHa/DDP细胞具有抑制作用，且呈一定的浓度依赖趋势，提示槲皮素单独应用可对SiHa/DDP细胞产生一定的抑制作用。进一步研究发现，槲皮素对SiHa/DDP细胞的逆转耐药倍数为4.00，表明槲皮素对顺铂耐药细胞SiHa/DDP具有一定逆转作用。这与杜春双等[7]的研究结果相吻合。

p70S6K是mTOR蛋白的下游底物，被p-mTOR蛋白激活后可调控细胞内p70S6K mRNA的表达，从而影响乳腺癌等恶性肿瘤的发生、发展[22]。P-gp是一种腺嘌呤核苷三磷酸依赖性跨膜转运蛋白，人体中P-gp越多则癌细胞产生耐药性的能力就越强，因此抑制P-gp蛋白的表达和功能是逆转多药耐药的重要途径[23]。其次，有研究表示，mTOR是PI3K/Akt/mTOR信号通路的下游成分之一，其抑制剂雷帕霉素可通过抑制该信号通路活性降低宫颈癌细胞的迁移与侵袭[24]。因此，本研究采用雷帕霉素作为本实验的抑制剂。本研究结果显示，经槲皮素联合顺铂处理后，SiHa/DDP细胞中的Akt、mTOR、p70S6K的蛋白磷酸化水平和P-gp蛋白表达水平均显著降低，这与槲皮素联合抑制剂雷帕霉素处理后的结果一致，进一步表明槲皮素可通过抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路，逆转SiHa/DDP细胞的耐药性。

综上所述，槲皮素可逆转SiHa/DDP细胞对顺铂的耐药性，其作用机制与抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路相关蛋白的表达有关。

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（收稿日期：2021-05-18 修回日期：2021-10-25 ）

（编辑：唐晓莲）