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miR-3607在胃癌中的表达及其与预后的相关性研究

2021-12-16张乙川杨成俊刘珂良

局解手术学杂志 2021年12期
关键词:细胞系结果显示胃癌

张乙川,李 玲,杨成俊,王 飞,刘珂良

(1.攀枝花学院附属医院消化疾病中心微创内镜中心,四川 攀枝花 617000;2.攀枝花学院附属医院消化疾病中心消化内科,四川 攀枝花 617000)

胃癌是常见的恶性肿瘤之一,多数患者在初次就诊时已为中晚期,导致其生存率较低[1-2]。因此有必要进一步阐明胃癌发生和发展的分子生物学机制,寻找有效的分子标记物,这将有助于胃癌的早期诊断,从而提高患者生存率,改善不良预后[3]。microRNA(miRNA)是一类内源性非编码小分子单链RNA,主要由单链RNA前体加工产生,长度一般为19~24 nt[4-5]。miRNA可影响细胞的增殖、分化、迁移、侵袭和凋亡,并参与各种疾病和肿瘤的生物学过程,探索miRNA的表达和相应的信号通路将为肿瘤的治疗提供新的药物靶点[6]。近年来,越来越多的学者致力于研究miR-3607的表达与肿瘤的关系,Liu等[7]使用miRCURY array LNA miRNA芯片评估在胃癌组织和正常组织之间的异常miRNA表达谱,其中miR-3607在胃癌组织中为异常低表达,故miR-3607在胃癌中可能参与胃癌的发生发展,但其在胃癌中的临床和功能性作用鲜有报道。因此,深入了解miR-3607在胃癌中的临床意义和潜在作用机制对于寻找新的胃癌生物标志物及潜在治疗靶点具有重要的价值。本研究通过检测miR-3607在胃癌组织和细胞中的表达水平,初步探讨了miR-3607在胃癌细胞增殖、迁移和侵袭中的作用,分析了其在胃癌预后评估中的价值,旨在为临床胃癌患者的治疗提供新的分子靶点和治疗策略。

1 材料与方法

1.1 患者和组织样本

选取2013~2015年在攀枝花学院附属医院进行胃癌切除术的117例患者。经手术切除分别获得直径为0.5 cm的胃癌组织和4 cm的相邻正常组织(癌旁组织)样本。新鲜样本立即于液氮中冷冻,于-80 ℃保存备用。所有胃癌样本均经病理确诊。参与试验的所有患者术前均签署知情同意书。本研究获得攀枝花学院附属医院医学伦理委员会批准(201311001)。

1.2 细胞培养和转染

胃癌细胞系(HGC-27、NCI-N87、AGS、MKN45)和正常上皮细胞系(GES-1)均购自中国科学院细胞库(中国上海)。所有细胞均在37 ℃、5% CO2环境下,含10%胎牛血清(FBS,GIBCO)的RPMI-1640培养基(Hyclone)中培养。待细胞生长到50%~80%时,按照Lipofectamine 3000试剂说明书转染细胞(Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA,美国),将miR-3607 mimic、miR-3607 inhibitor、mimic NC、inhibitor NC转染至HGC-27和MKN45细胞内(未处理细胞为Control)用于后续实验。

1.3 总RNA提取和实时定量PCR(qRT-PCR)分析

采用Trizol法提取总RNA(Invitrogen,Thermo Fisher Scientific,Waltham,美国)。NanoDrop 2000分光光度计(Thermo Fisher Scientific,Waltham,美国)用来定量RNA。严格按照PrimeScript RT试剂盒(Takara,Otsu,Japan)说明书进行逆转录。在ABI 7500 PCR系统上,按照SYBR-Green I Master混合试剂盒的说明书进行qRT-PCR(Thermo Fisher Scientific,Waltham,美国)分析。反应条件:94 ℃变性10 min,接着35个循环94 ℃,30 s;58 ℃,30 s;72 ℃,30 s。PCR引物序列:miR-3607 上游5’-GGGACTGTAAACGCTT-3’,下游5’-CTCAACTGGTGTCGTGGA-3’;U6上游5’-GCT-TCGGCAGCACATATACTAAAAT-3’,下游 5’-CGCTT-CACGAATTTGCGTGTCAT-3’。采用2-ΔΔCt方法计算miR-3607的相对表达水平并将其归一到内参基因U6。

1.4 CCK-8法检测细胞增殖能力

在96孔板上进行细胞增殖实验,每孔2×103个细胞。孔中加入10 μL CCK-8溶液(Dojindo,Kumamoto,日本),于37 ℃、5% CO2环境下培养2 h,450 nm处测量其吸光度,实验平行重复3次。

1.5 Transwell法检测细胞迁移及侵袭能力

利用Transwell实验检测细胞的侵袭和迁移能力。在进行细胞侵袭实验之前,基质被预涂到Transwell的上腔室中,然后在上腔室加入100 μL无血清培养基配制细胞悬浮液,下室加入500 μL含10%胎牛血清的培养液,培养24 h后,固定30 min并用0.1%结晶紫染色20 min。在光学显微镜下观察细胞数并计数。迁移实验Transwell上腔室不需要预涂基质,其他步骤与侵袭实验相同。

1.6 胃癌患者临床病历资料收集和预后分析

根据电子病历收集并记录所有患者的临床资料,主要包括年龄、性别、肿瘤大小、分化程度、淋巴结转移、TNM分期。根据胃癌患者组织中miR-3607的平均表达值,将患者分为低表达组和高表达组。术后2年内每3个月随访1次,随后每6个月随访1次,最后1年随访1次,收集患者5年总生存随访记录。结合miR-3607在组织中的表达水平和总生存率,使用Kaplan-Meier和多因素Cox回归分析评估miR-3607在胃癌中的预后价值。

1.7 统计学分析

采用SPSS 22.0和GraphPad Prism 5.0软件进行统计学分析。2组间均数比较采用t检验,多组间比较采用one-wayANOVA分析。采用Kaplan-Meier绘制患者的总体生存曲线,Cox比例风险回归模型进行多因素分析。P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 胃癌组织和胃癌细胞系中miR-3607表达水平

qRT-PCR检测结果显示,与癌旁组织相比,miR-3607在胃癌组织中的表达显著下调(P<0.05),见图1a。与正常上皮细胞系GES-1相比,胃癌细胞系HGC-27、NCI-N87、AGS、MKN45中miR-3607的表达水平较低(P<0.001),见图1b。

a:胃癌组织和癌旁组织中miR-3607的表达;b:胃癌细胞系中miR-3607的表达 *:与癌旁组织比较,P<0.05;#:与GES-1比较,P<0.001

2.2 miR-3607下调促进胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭

qRT-PCR结果显示,与Control相比,miR-3607 mimic中miR-3607的表达显著增加,而miR-3607inhibitor中miR-3607的表达降低(P<0.001),见图2a。CCK-8法检测结果显示,与Control相比,miR-3607的低表达可以促进胃癌细胞的增殖,而高表达的miR-3607可以抑制胃癌细胞的增殖(P<0.05),见图2b。Transwell法检测HGC-27和MKN45细胞的迁移和侵袭能力,结果显示,与Control相比,miR-3607的低表达显著增强了胃癌细胞的迁移和侵袭能力(P<0.05),见图3。

a:qRT-PCR检测miR-3607在HGC-27和MKN45细胞中的表达水平;b:CCK-8法检测细胞增殖 #:与Control比较,P<0.001;*:与Control比较,P<0.05

a:细胞迁移能力;b:细胞侵袭能力 #:与Control比较,P<0.001;*:与Control比较,P<0.05

2.3 胃癌患者临床特征与miR-3607表达的关系

根据miR-3607表达的平均值将患者分为低表达组(n=60)和高表达组(n=57)。经分析发现,miR-3607的表达与淋巴结转移(P=0.037)和TNM分期(P=0.032)相关,而与患者的年龄、性别、肿瘤大小和分化程度无关(P>0.05),见表1。

表1 miR-3607表达与胃癌患者临床特征的相关性(例)

2.4 miR-3607表达下调与胃癌患者预后不良的相关性

3 讨论

胃癌是世界范围内发病率和病死率均较高的恶性肿瘤,近年来引起了人们的广泛关注[8-9]。胃癌的发病机制复杂多样,涉及许多生物遗传和表观遗传学变化[10-11]。目前,越来越多的证据表明,miRNAs在多种人类癌症的发病机制中起着关键作用[12-14]。这些小的非编码RNA具有调控基因表达的能力,通常参与多种生物过程中的关键过程,如癌变。有证据表明,miRNA可以影响胃癌细胞的增殖、分化、凋亡,并参与胃癌的病理过程[15-16]。因此,miRNA在胃癌的诊断及预后评估等方面具有重要的作用。

miR-3607的异常表达与多种癌症的进展密切相关。有研究显示,miR-3607通过靶向TGFBR1和CCNE2抑制非小细胞肺癌细胞的生长和转移,其在非小细胞肺癌组织中表达下调,并与患者预后相关,可以作为非小细胞肺癌的潜在非侵入性生物标志物[17]。然而miR-3607的表达在胃癌中发挥的作用尚不清楚。本研究结果显示,miR-3607在胃癌组织中的表达水平显著低于癌旁组织,且在胃癌细胞系中表达下调;此外,miR-3607低表达的患者多数表现为TNM晚期和淋巴结转移。且有研究表明,miR-3607在肝癌和结直肠癌中同样表现为低表达并参与肿瘤进展[18-19]。说明miR-3607的下调同样可能参与了胃癌的进展。

图4 胃癌患者生存时间的Kaplan-Meier曲线

表2 多因素Cox回归分析

由于miR-3607在胃癌组织和高侵袭细胞系中低表达,我们推测miR-3607可能在胃癌中发挥抑癌的作用。为了验证这一点,本研究评估了miR-3607对胃癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响,结果显示,miR-3607低表达显著提高了胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力,而miR-3607高表达则降低了细胞的增殖、迁移和侵袭能力,这提示miR-3607高表达可能在胃癌中发挥抑制作用。有研究显示,miR-3607在肝癌细胞中的表达降低提示不良预后,而其在肝癌细胞中过表达会抑制肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭,这为肝癌的治疗和预后提供了新的方向[18]。本研究进一步研究了miR-3607在胃癌中的预后意义,结果显示,miR-3607低表达的患者预后较差且是独立预后风险因子,表明miR-3607可能作为胃癌患者预后不良的潜在预测因子。然而miR-3607在胃癌中的具体作用机制尚未阐明,其在胃癌中的临床预后价值还需进一步确认,在以后的工作中,我们会对此进行深入研究。

综上所述,miR-3607在胃癌组织和细胞系中显著下调,并且与患者生存期短有关,是影响胃癌患者预后不良的独立危险因素,其可能成为预测胃癌患者预后不良的生物标志物。此外,miR-3607高表达可以抑制胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭,表明miR-3607有望成为胃癌的潜在治疗靶点。

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