22种不同来源信阳毛尖茶的分类比较

张 洁，陈思敏，任小盈，马存强2,, ，马冰凇，王子浩

（1.信阳农林学院茶学院, 河南信阳 464000；2.信阳农林学院, 河南省豫南茶树资源综合开发重点实验室, 河南信阳 464000；3.云南农业大学龙润普洱茶学院, 云南昆明 650201；4.聊城高级财经职业学校, 山东聊城 252000）

茶叶(Camellia sinensisL.)是世界上最受欢迎的风味、功能性的非酒精饮料。消费人群占世界总人口的三分之二。信阳毛尖茶为产自中国中部的一种著名烘青绿茶，由茶树鲜叶经摊放、杀青、揉捻、干燥等工序加工而成[1]。在特定地区规定采制期内加工而成的毛尖茶，由于其优良品质具有较高的经济收益[2]。一般认为，产自“五云山”（车云山、集云山、云雾山、天云山、连云山）、“两潭”（黑龙潭、白龙潭）和“一寨”(何家寨）等特定区域内的明前茶（清明节前采制的茶）为信阳毛尖茶中的极品[3]。

茶多酚(Tea polyphenols)占茶树鲜叶干物质重的18%~36%，具有抗氧化、抗炎特性，以及降低癌症和糖尿病几率、降血脂和抗肥胖等多种生物活性[4]，主要包括儿茶素类(Catechins)、黄酮醇类(Flavonols)、黄酮类(Flavonoids)、花青素类(Anthocyanins)和酚酸类(Phenolic acids)等[5]。其中，儿茶素类为茶多酚的主体成分，占茶多酚总量的60%~80%。在茶叶中共检出(+)-儿茶素(Catechin, C)、(+)-没食子儿茶素(Gallocatechin, GC)、(-)-表儿茶素 (Epicatechin, EC)、(-)-表没食子儿茶素(Epigallocatechin, EGC)等非酯型儿茶素和(-)-儿茶素没食子酸酯(Catechin galllate,CG)、(-)-表儿茶素没食子酸酯(Epicatechin gallate,ECG)、(-)-没食子儿茶素没食子酸酯(Gallocatechin gallate, GCG)和 (-)-表没食子儿茶素没食子酸酯(Epigallocatechin gallate, EGCG)等酯型儿茶素[6]。基于酚类化合物组成及其含量差异，可进行茶叶的分类比较和产地溯源[7−8]。另外，ZHOU 等[9−10]根据酚类化合物、嘌呤碱以及氨基酸含量组成对普洱茶进行了分类比较。

本研究采用高效液相色谱(High performance liquid chromatography, HPLC)等方法对不同来源的22款信阳毛尖茶茶样中8种儿茶素、6种黄酮类、2种酚酸、3种嘌呤碱等活性成分以及茶多酚、可溶性糖和游离氨基酸总量等主要品质成分进行测定，比较不同采制时节、产地和等级信阳毛尖茶的品质成分差异，为明前茶的识别提供一定参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

信阳毛尖茶 以2019年3月至5月天云山、四望山两地不同采制时节信阳群体种茶树鲜叶加工而成的22款特级及其以上的信阳毛尖茶为试验材料（表1）。根据产地可分为天云山和四望山；根据茶叶规格可分为芽头、次芽和楼头三个不同等级；根据采制时节可分为明前、雨前和春尾；8个儿茶素标品（纯度98%）：C、EC、EGC、GC、ECG、CG、GCG、EGCG、没食子酸、鞣花酸、1,4,6-三-O-没食子酰基-β-D-葡萄糖(水解单宁，1,4,6-tri-O-galloyl-β-D-glucose,GG） 上海源叶生物科技；6个黄酮类标品（纯度98%）：槲皮素、山奈酚、杨梅素、芦丁、花旗松素、木犀草素 成都曼斯特生物科技；咖啡碱、可可碱、茶碱标品（纯度98%） 美国Sigma-Aldrich公司；甲醇、乙腈 色谱级，美国Thermo Fisher公司。

表1 22款信阳毛尖茶信息及分组Table 1 Information of 22 Xinyang Maojian tea samples and their grouping

Heraeus Fresco17高速离心机 美国Thermo Fisher公司；JXFSTPRP-24 研磨仪 上海净信科技；TU-1901 紫外-可见分光光度计 北京普析技术；1200型HPLC仪 美国Agilent公司。

1.2 实验方法

1.2.1 主要品质成分分析 参照《GB 5009.3-2016食品安全国家标准 食品中水分的测定》进行茶叶中水分的测定。以没食子酸为参照，采用福林酚试剂在765 nm波长下进行茶叶中的茶多酚含量测定[11−12]。采用蒽醌试剂在620 nm波长下进行茶叶中可溶性糖总量的测定[12−13]。游离氨基酸总量采用的茚三酮比色法在570 nm波长下进行测定[14]。

1.2.2 茶汤浸提 茶样经研磨仪研磨，40目筛网过筛后，−20 ℃保存备用。称取1.0 g茶叶研磨样品，加入40 mL甲醇和4 mL盐酸于圆底烧瓶85 ℃回流浸提90 min，冷却过滤后，通过甲醇定容至50 mL。0.45 μm尼龙滤膜过滤后用于HPLC检测[15]。

1.2.3 儿茶素、黄酮类、酚酸和嘌呤碱等活性成分的HPLC定量检测 参照NIAN等[16]构建的茶叶中活性成分HPLC定量检测方法，采用Agilent1200型HPLC仪连接Poroshell 120 EC-C18色谱柱(4.6 mm×100 mm, 2.7 μm)和C18保护柱(4.6 mm×10 mm, 5 μm)对信阳毛尖茶中的儿茶素、黄酮类、酚酸类以及嘌呤碱等活性成分含量进行定量测定。流动相A为0.261%磷酸、5%乙腈，流动相B为80%甲醇；洗脱梯度程序见表2。柱温为30 ℃；0~20 min检测波长为280 nm；20~36 min检测波长为360 nm；进样体积为2 μL。

表2 HPLC洗脱程序Table 2 Elution program of HPLC

1.2.4 数据处理 每个茶样进行三次测定重复。数据采用均值±标准差表示。采用SPSS 20.0软件进行单因素方差分析和独立样本t检验。采用Origin 9.0软件进行主成分分析(Principal component analysis, PCA)和聚类分析(Hierarchical cluster analysis, HCA)。采用MetaboAnalyst 5.0进行不同采制时节信阳毛尖茶的偏最小二乘法-判别分析(Partial least squares -discriminant analysis，PLS-DA)。

2 结果分析

2.1 信阳毛尖茶的PCA、HCA和PLS-DA分析

不同来源的22种信阳毛尖中茶多酚、可溶性总糖、游离氨基酸总量以及儿茶素、黄酮类、酚酸和嘌呤碱含量如表3所示。

表3 22个茶样中儿茶素、黄酮类、酚酸类、嘌呤碱等主要品质成分含量Table 3 Contents of catechins, flavonoids, phenolic acids, purine alkaloids and other main quality components in 22 tea samples

PCA、HCA和PLS-DA等多元统计学分析（图1）揭示了采制时节是影响信阳毛尖茶品质成分的主要因素。在PCA中（图1A），PC1和PC2分别解释了总方差的32.3%和15.9%，显示了明前茶与雨前和春尾茶的显著差异。由于雨前茶在采制时节上介于明前和春尾之间，部分茶样与明前茶和春尾茶有一定重叠。HCA（图1B）同样能完成大多数明前茶和春尾茶的层次聚类，显示了明前茶与春尾茶之间的差异显著。HCA将23个品质成分分为三组。一组（蓝色）主要包括山奈酚、木犀草素、C和游离氨基酸总量等品质成分，在明前、雨前和春尾等不同茶组中呈下降趋势；在明前茶中含量最高。二组（绿色）主要包括可溶性糖、茶碱、杨梅素、芦丁、EGC和EC等品质成分，在不同茶组之间保持稳定或呈小幅度上升趋势。三组（红色）主要包括咖啡碱等嘌呤碱、没食子酸等酚酸、EGCG和ECG等酯型儿茶素以及槲皮素和花旗松素等黄酮类，在不同茶组中整体呈降低趋势；在春尾组和楼头组中含量最高。明前、雨前和春尾茶的PLS-DA（图1C）中，成分1和成分2分别解释了总方差的59.5%和16.7%，在95%的置信度内能完成明前茶和雨前茶的判别分析。另外，PLS-DA显示游离氨基酸；儿茶素C、EGC和GC；以及可溶性糖和茶多酚等品质成分为采制时节识别的关键差异物质。整体来说，通过多元统计学分析可基本实现对信阳毛尖茶中明前茶的鉴定识别。同时，也发现产地和等级差异，对明前茶的鉴定识别有一定的影响。

图1 不同来源信阳毛尖茶的主成分分析(A)、层次聚类分析(B)和偏最小二乘法判别分析(C)Fig.1 PCA (A), HCA (B) and PLS-DA (C) for Xinyang Maojian teas from various origins

2.2 不同采制时节信阳毛尖茶的品质成分差异

许多研究证实了茶叶品质成分的季节性波动。一般认为，春茶中游离氨基酸含量较高、儿茶素含量适中；相反，夏秋茶中的游离氨基酸总量较低，而儿茶素、黄酮类和花青素类等酚类物质大量累积[17−19]。LIU等[20]通过代谢组学揭示在春季的短时间内，茶芽中主要氨基酸呈下降趋势，而EC、EGC、EGCG、GC和CG等儿茶素呈显著增加趋势。明前、雨前和春尾信阳毛尖茶中的品质成分含量如表4所示。不同采制时节的信阳毛尖茶之间在鞣花酸、GG、花旗松素和咖啡碱含量无显著差异(P>0.05)，在游离氨基酸总量、8种儿茶素、没食子酸、5种黄酮类和2种嘌呤碱方面存在极显著差异(P<0.01)。单因素方差分析显示明前茶中游离氨基酸总量和C含量最高，而GC、EGC、ECG、EGCG、没食子酸、芦丁、杨梅素、槲皮素、可可碱含量最低，与明前茶和春尾茶存在显著(P<0.05)或极显著差异(P<0.01)，是明前茶鲜爽度较高的物质基础[20−21]。春尾茶中ECG、EGCG、GCG和CG等酯型儿茶素和GC含量最高，这在一定程度上增加了春尾茶的苦涩度[21−22]。雨前茶中芦丁、山奈酚、杨梅素等黄酮类含量最高。在茶树生理中，没食子酸和黄酮类等是酯型儿茶素合成的前体物质[23]。没食子酸和黄酮类含量的增加为雨前和春尾茶中酯型儿茶素的累积奠定了物质基础。

表4 明前、雨前和春尾信阳毛尖茶的主要品质成分含量和差异Table 4 Contents and differences of main quality components in Xinyang Maojian teas among Mingqian,Yuqian and Chunwei

2.3 天云山和四望山毛尖茶的品质成分对比分析

由于地理环境和气候条件的差异，前人采用HPLC、LC-MS/MS和GC-MS/MS代谢组学发现多种与产地识别相关的差异化代谢物[24−26]。天云山和四望山均位于信阳市浉河区，两地自然环境和气候条件相近。如图2所示，两地之间仅在茶多酚、游离氨基酸总量、非酯型儿茶素总量、黄酮总量和没食子酸等品质成分（图2A）上存在显著(P<0.05)或极显著差异 (P<0.01)。在 8种儿茶素中（图2B），仅在 C、GC和ECG含量上存在显著差异(P<0.05)，在其他5种儿茶素，如EGCG含量上无显著差异(P>0.05)。在6种黄酮类化合物中（图2C）,在芦丁、花旗松素、槲皮素和木犀草素含量上存在显著(P<0.05)或极显著差异(P<0.01)。相对而言，四望山毛尖茶含有更高的茶多酚和非酯型儿茶素总量以及较低的游离氨基酸总量和黄酮总量。酚类化合物和游离氨基酸总量的差异在一定程度上影响了信阳毛尖茶的香气、滋味、色泽。

图2 天云山和四望山毛尖茶中的品质成分差异Fig.2 Differences of quality components in teas between Mount Tianyun and Siwang

2.4 不同等级毛尖茶的品质成分差异

不同等级绿茶、红茶在酚类化合物、抗氧化能力、抗溶血活性等方面存在显著差异[27]。信阳毛尖按照鲜叶分级指标共分为珍品、特级、一级、二级、三级和四级等不同的级别[28]。而市场上销售的信阳毛尖多分为芽头、次芽、楼头和芽叶等不同等级。本文参照行业标准，将收集到的毛尖茶分为芽头、次芽和楼头三个等级。按照鲜叶分级指标，这三个等级均以单芽为主，一芽一叶为辅。由于茶叶级别相近，不同等级毛尖茶在茶多酚总量、可溶性糖总量、黄酮总量以及没食子酸、鞣花酸、EGCG、ECG、咖啡碱、可可碱、芦丁等品质成分上均无显著差异(P>0.05)，仅在游离氨基酸总量、茶碱、GG(图3A)、C、EC、EGC（图3B）、花旗松素、山奈酚、杨梅素（图3C）等含量上存在显著(P<0.05)或极显著差异(P<0.01)。特别是C，在芽头中含量最高、在次芽中含量次之、在楼头中含量最低。与EGC在不同等级毛尖茶中的分布相反。这在一定程度上为信阳毛尖茶等级识别提供了参考。

图3 不同档次信阳毛尖茶主要品质成分含量对比Fig.3 Comparisons of the main quality components in Xinyang Maojian tea among different grades

3 讨论与结论

本课题组之前采用HPLC等方法对景迈和芒景两地晒青绿茶进行了产地识别，并借助LC-MS/MS代谢组学初步探究了浉河、商城、罗山所产信阳毛尖茶的代谢组分差异[29−30]。为了探究产地、等级、采制时节等因素对信阳毛尖茶品质成分的影响，本文采用HPLC和紫外-可见分光光度计法对22个不同来源信阳毛尖茶样中的儿茶素、黄酮类、酚酸和嘌呤碱等20个活性成分以及茶多酚、可溶性糖和游离氨基酸总量等主要品质成分进行测定。

PCA、HCA和PLS-DA均显示了采制时节是影响信阳毛尖茶品质成分的主要因素。信阳毛尖茶基本可按照采制时节分为明前茶、雨前茶和春尾茶。PLS-DA确定游离氨基酸、儿茶素C、EGC和GC、以及可溶性糖和茶多酚等品质成分为信阳毛尖采制时节识别的关键差异物质。单因素方差分析显示明前茶、雨前茶和春尾茶在游离氨基酸总量、8种儿茶素、没食子酸、5种黄酮类和2种嘌呤碱等品质成分存在极显著差异(P<0.01)。明前茶中游离氨基酸总量和 C含量最高，CG、ECG、GCG、EGC、EGCG、没食子酸、芦丁、杨梅素、槲皮素含量最低，与明前茶和春尾茶存在显著(P<0.05)或极显著差异(P<0.01)；春尾茶中ECG、EGCG、GCG和CG等酯型儿茶素和GC含量最高。这与前人研究结果基本一致[13−15]。本研究同时也发现雨前茶中黄酮总量以及芦丁、山奈酚、杨梅素和没食子含量极显著(P<0.01)高于明前茶和春尾茶，这可能与不同采摘时期茶树生理中酯型儿茶素的合成代谢差异有关。

相对于采制时节，由于天云山和四望山地理环境和气候条件相近，两地毛尖茶仅在C、GC、ECG等儿茶素和芦丁、花旗松素、槲皮素、木犀草素等黄酮含量上存在显著(P<0.05)或极显著差异(P<0.01)。不同等级信阳毛尖茶在游离氨基酸、茶碱、GG、C、EC、EGC、花旗松素、山奈酚、杨梅素等含量上存在显著(P<0.05)或极显著差异(P<0.01)。这在一定程度上影响了信阳毛尖采制时节的识别鉴定。