基于分子对接技术与网络药理学分析方法的半夏-黄连药对治疗胃食管反流病的作用机制研究

甘丽华, 李志敏, 何 泉, 杨 坤, 郭超峰

(1. 广西中医药大学, 广西 南宁, 530000; 2. 广西中医药大学基础医学院, 广西 南宁, 530000)

胃食管反流病(GERD)是由多种因素导致食管下括约肌功能障碍的胃食管动力障碍性疾病，反流、烧心是其典型症状，中国人群流行病学调查显示，每周至少发作1次烧心症状的概率为1.9%～7.0%[1]。GERD的基础治疗方法是调整生活习惯与饮食方式，常用的治疗药物有抑酸药、促胃肠动力药、黏膜保护剂、抗反流药物等。轻度食管炎的短期服药效果较快，但停药后症状易反复，难治性GERD需长期服药，患者依从性差[2]。药物治疗效果不佳的患者可选择胃镜和外科手术进行抗反流，但治疗风险大[3]。张娇等[4-5]对治疗GERD的中药进行聚类分析得出，使用频次最高的药对是半夏-黄连。半夏能燥湿化痰，降逆止呕，具有镇静抗炎、止呕、抗肿瘤等药理作用; 黄连能清热燥湿、泻火解毒，用于湿热痞满、呕吐吞酸、泄痢等疾病。现代研究[6]表明，中药半夏、黄连具有抑制胃液分泌，提高胃内pH值，抑制胃蛋白酶活性，保护胃黏膜的作用，但作用机制尚未明确。本研究采用网络药理学分析方法探讨“半夏-黄连”治疗GERD的活性成分、相关靶点及信号通路，并结合分子对接技术验证有效成分与重要靶点间的亲和关系，为“半夏-黄连”治疗GERD提供参考依据。

1 资料与方法

1.1 半夏-黄连活性成分及靶点预测

借助中药系统药理学数据库与分析平台(TCMSP)(http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)设置生物口服利用度(OB)≥30%, 类药性(DL)≥0.18, 筛选半夏、黄连的有效成分及活性靶点，利用通用蛋白质数据库 Uniprot(https://www.uniprot.org/)将靶点蛋白全称转换成简称，整合靶点蛋白，删除数据库不存在的蛋白，最终得到半夏-黄连有效成分的靶点。

1.2 疾病靶点预测

以“gastroesophageal reflux disease”为检索关键词, “Homo sapiens”为研究对象在Gene Cards数据库(https://www.genecards.org/)中收集GERD的相关基因。

1.3 药物对疾病潜在靶点预测和调控网络图

运用R语言分析软件R3.6.1(https://www.r-project.org/)对半夏-黄连的靶点蛋白与GERD的相关基因进行取交集操作，找出两者的交集并绘制出Venn图，初步预测半夏-黄连治疗GERD的作用靶点。采用网络拓扑属性分析软件Cytoscape3.7.2(http://cytoscape.org/)构建药物-有效成分-疾病-靶基因思维关系图，并将其关系进行可视化。

1.4 蛋白互作(PPI)网络的构建

采用蛋白质互作平台 STRING(https://www.string-db.org/)对“药物有效成分-疾病相交集的蛋白”进行蛋白-蛋白相互作用的PPI网络图绘制并找出核心基因。

1.5 基因本体论(GO)分析与基因和基因组的京都百科全书(KEGG)分析

利用David 6.8数据库(https://david.ncifcrf.gov/)对PPI网络中的作用靶点进行GO基因功能分析及KEGG信号通路分析。

1.6 分子对接验证核心靶点与有效成分

采用AutoDock软件对“药物-有效成分-疾病-靶基因”思维关系图中度值前5位的靶点蛋白与重要成分进行分子对接验证。从PDB(https://www.rcsb.org/)数据库下载核心蛋白3D结构，采用PyMol软件分离靶点蛋白中的配体和水分子，将配体和蛋白均保存为pdb格式文件; 其次，运用AutoDock Tools软件将核心蛋白、配体和mol2格式的化合物均转换为pdbqt格式文件，再以配体为中心寻找活性口袋及Grid Box中心坐标; 利用AutoDock Vina软件进行分子对接，最后选取对接结合能最低的结果，运用PyMol软件将其可视化。

2 结 果

2.1 药物有效成分及靶点预测

以OB>30%, DL>0.18为筛选标准，从TCMSP中共检索出27个活性化合物，其中半夏、黄连分别有13、14个有效成分，参数信息见表1。利用UniProt 数据库对半夏-黄连的1 883个靶蛋白进行简称转换、合并去重处理后，两者共同靶点为195个，有活性成分对应的作用靶点186个。

表1 半夏-黄连药对活性成分

2.2 半夏-黄连调控GERD网络图

采用Cytoscape 软件构建“药物-有效成分-疾病-靶基因”思维关系图，分析结果显示，该网络共有129个节点, 524条边。根据节点度值(Degree)的大小，判断其效果, Degree越大，说明该有效成分连接靶点数目越多，其作用越显著，其中槲皮素(Degree=82)、黄芩苷(Degree=23)、β-谷甾醇(Degree=22)、(R)-氢化小檗碱(Degree=15)、豆甾醇(Degree=15), 见图1。

2.3 PPI 网络及关键靶点

采用R软件对药物的186个作用靶点及疾病的2 960个相关基因取交集后共得到106个交集靶蛋白，见图2。利用STRING数据平台对交集靶蛋白绘制PPI网络图，图中含有106个靶蛋白和397组互作边，其中胰蛋白酶原(PRSS1) 是游离蛋白，故将其删除。节点代表1个蛋白，两蛋白之间用边相连，边的度值由蓝色变黄色表示逐渐变小，边越粗表示核心地位越高。其中排名前5位的蛋白分子为苏氨酸蛋白激酶1(AKT1)、半胱天冬酶3(CASP3)、血管内皮生长因子A(VEGFA)、人原癌基因(JUN)、白细胞介素-6(IL-6)。度值越大的蛋白质在整个网络中越起关键作用，同时也是半夏-黄连治疗GERD的关键靶点，见图3、4。

2.4 “半夏-黄连”关键靶点的分子对接验证

由PPI网络图可知，排名前5名的关键靶点为AKT1、IL-6、CASP3、JUN、VEGFA。采用AutoDock Vina软件对5个关键靶点与活性成分槲皮素、黄芩苷、β-谷甾醇进行分子对接验证。一般认为，配体与受体结合能越低，结合的构象越稳定，结合能小于0说明配体与受体可以自发结合。分析可知，靶点-化合物结合能从小到大排列为: IL-6与β-谷甾醇(-8.3 kcal/mol)、CASP3与β-谷甾醇(-7.1 kcal/mol)、AKT1与黄芩苷(-5.5 kcal/mol)、VEFGA与黄芩苷(-4.4 kcal/mol)、JUN与黄芩苷(-4.8 kcal/mol), 其中IL-6与β-谷甾醇(-8.3 kcal/mol)具有较强的结合力，利用Pymol软件对接结合能最低的化合物进行可视化处理，见图5。

2.5 GO富集分析和KEGG通路分析

GO基因功能分析共包括969条，生物过程(BP)827条，主要包括氧化应激反应、对脂多糖反应、对细菌来源分子的反应等; 细胞组成(CC)64条，主要包括膜筏、膜微结构域、膜区域等; 分子功能(MF)78条，主要包括泛素样分子链接酶、激酶调节活动、血红素结合等。将P值排序，点越大则富集基因越多,P值越小颜色越红。取前20条通过R软件转化为气泡图，见图6、7、8。KEGG信号通路分析得到121条通路，主要有丙型肝炎、丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路、细胞衰老、PI3K/AKT信号通路等，体现了半夏-黄连治疗过程中参与多通路的特点，见图9。

3 讨 论

GERD的发病机制包括胃食管交界处结构和功能障碍、食管清除能力与上皮防御功能失衡、食管抗反流功能下降及食管敏感性增高、免疫因素介导食管黏膜损伤等[7-8]。GERD在中医学属“吐酸、食管瘅”范畴，病机多为木郁土虚，湿邪郁阻中焦，气机升降失调，胃气上逆。发病过程中会出现湿郁化热、痰阻气滞等过程，治则是清热燥湿，祛痰降逆，兼以疏肝理气[9]。半夏具有辛温燥热，祛痰降逆功效; 黄连具备苦寒降泄，清热燥湿功能，两药配合，寒热互用以和其阴阳，辛开苦降以调其升降，消湿热之痞，化痰浊之结[4]。

本研究通过网络药理学及分子对接技术对“半夏-黄连”治疗GERD的机制进行初步探讨，共筛选出半夏-黄连活性成分27个，关键靶点186个。根据药物-有效成分-疾病-靶点关系图可知，槲皮素、黄芩苷、β-谷甾醇、(R)-氢化小檗碱、豆甾醇有较多靶点蛋白对应，表明上述化合物可能是治疗GERD的关键活性成分。组胺广泛分布在消化道的各种细胞中, KITANO M等[10]研究表明，组胺可刺激酸分泌和破坏细胞黏膜，槲皮素能有效抑制组胺的浓度，抑制酸的分泌，保护食管黏膜。YOH T等[11]研究发现，单纯抑制胃酸分泌并不能改善食管下括约肌的功能，体内自由基浓度增加可引起脂质过氧化，导致活性氧升高，蛋白质及核酸变性，造成细胞组织损伤从而出现反酸、烧心等症状。槲皮素可有效清除自由基，显著降低脂质过氧化，保护组织黏膜[12]。黄芩苷也具有抗氧化作用，能清除氧自由基的来源，减少组织损伤，延缓细胞衰老[13]。此外，黄芩苷可降低CASP3和Bax水平，调节PI3K/Akt信号通路表达，改善受损的血管内皮功能和调节氧化应激反应[14]。PANDITH H等[15]通过体外试验发现，豆甾醇能抑制脂多糖(LPS)诱导的环氧酶2(COX-2)、诱导型一氧化氮合成酶(iNOS) mRNA水平提高，下调前列腺素E2(PGE2)和NO的释放，维持黏膜屏障功能。β-谷甾醇除具有清除羟自由基的抗氧化作用外，还可增加抗菌肽表达，在细菌作用位点结合，起杀死致病菌的作用; 同样β-谷甾醇通过抑制表皮细胞、巨噬细胞及MAPK信号通路的激活，导致TNF-α、IL-6和白细胞介素-8(IL-8)生成减少从而起到抗炎作用[16]。(R)-氢化小檗碱是黄连素的衍生物，动物实验[17]显示氢化小檗碱具有明显的镇痛抗炎作用。

由PPI网络图可知，相互作用关系较多的靶点是AKT1、CASP3、VEGFA、JUN、IL-6, 这些靶点通过各种联系参与多种生物过程。食管功能改变和食管黏膜损伤是GERD重要发病机制，除外化学损伤还可能涉及自身免疫。研究[18]表明贲门失弛缓症患者的血清和血浆中发现IL-6明显升高, IL-6是重要的免疫调节因子及炎症介质，PALMIERI O等[19]研究证明, IL-6在贲门失弛缓症中造成神经损伤并介导炎症反应的发生。肿瘤血管的形成对实体肿瘤存活至关重要, VEGFA是促进肿瘤血管形成的重要因子，可刺激血管内皮细胞增殖，介导肿瘤血管的形成，主要通过与血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)结合激活酪氨酸激酶，使自身磷酸化，触发级联反应，促进肿瘤血管新生[20]。CASP3是细胞凋亡信号通路中的关键位点，介导外部和内在的线粒体通路，催化多种蛋白特异性裂解，降解细胞目标，触发细胞凋亡[21]。AKT1参与细胞增殖生长、代谢和血管生成等多种过程，是PI3K/Akt信号通路上的关键基因, PI3K/Akt信号通路可刺激食管肿瘤细胞增殖转移，而磷酸化AKT1可使食管癌患者局部组织生存期缩短[22]。JUN是活化蛋白1(AP-1)构成单位之一，在食管癌表达中抑制AP-1转录活性，阻断信号通路传导，可抑制食管癌肿瘤细胞增殖[23]。

KEGG通路分析可知，半夏-黄连可通过PI3K/Akt信号通路、MAPK信号通路及NF-κB信号通路发挥治疗GERD的作用。AutoDock Vina分子对接结果显示，半夏-黄连与GERD的作用靶点有较好的结合活性，其中结合力最强的是IL-6与β-谷甾醇。VEGFA信号通路是抗食管癌血管形成的治疗靶点, VEGF是PI3K/Akt信号通路激活的膜受体, VEGF过度活化可诱导食管黏膜组织相关癌变。张锋利等[24]实验证实，降低VEGF表达水平，抑制PI3K/Akt信号通路活化，能够有效抑制正常细胞向癌细胞的增殖分化。MAPK信号通路通过诱导通路上位点Hsp70和Hsp27发挥食管血管内皮细胞对酸性物质的应激反应，减少黏膜损伤[25]。炎症因子是参与破坏食管黏膜屏障的因素之一，人食管黏膜细胞内白细胞介素-1β(IL-1β)和 IL-8炎症因子的表达，可激活食管黏膜内NF-κB信号通路，该通路的激活促使大量炎症细胞聚集，开启炎症级联反应。同时炎症因子可阻断紧密连接蛋白表达与分布，加重反流对食管黏膜上皮的损害[26]。

本研究通过网络药理学对半夏-黄连药对治疗GERD的有效成分、作用靶点及相关通路进行了初步探索，并通过Autodock分子对接软件验证了半夏-黄连核心成分与关键靶点之间存在较好结合度，有效证明了网络药理学预测靶点的可靠性。结果显示，半夏-黄连可能将活性成分槲皮素、黄芩苷、β-谷甾醇作用于AKT1、IL-6、CASP3等靶点，调控PI3K/Akt信号通路、MAPK信号通路及NF-κB信号通路，参与炎症反应、氧化反应、细胞凋亡等生理病理过程以发挥治疗GERD的作用。但本研究缺乏动物实验验证，且数据库信息更新不及时，因此也具有一定的不足之处。