玉木耳漆酶基因Aclac的克隆及原核表达

苏文英 谭一罗 刘晓梅 杨和川 秦裕营 李晓 任立凯

摘要：【目的】對玉木耳漆酶基因Aclac进行克隆及原核表达分析，为深入研究漆酶基因在玉木耳子实体发育中的生物学功能提供理论依据。【方法】克隆Aclac基因的cDNA和DNA全长序列，对其进行生物信息学分析，并将目的基因连接至pET-28a质粒上以构建原核表达载体pET28a-Aclac，将其转化大肠杆菌BL21（DE3）中诱导表达。【结果】克隆获得的Aclac基因cDNA序列长度为1734 bp，编码577个氨基酸残基;Aclac基因DNA序列长度为2521 bp，含14个内含子。AcLAC蛋白理论分子量为64.75 kD，理论等电点为5.70，不稳定指数为34.01，无跨膜区域，存在1个信号肽，在4个铜离子结合区高度保守，且含有Cupredoxin超家族蛋白保守功能域。AcLAC蛋白与真菌的漆酶蛋白聚为一支，其中，AcLAC蛋白与木耳属真菌的漆酶蛋白亲缘关系最近。AcLAC融合蛋白在大肠杆菌BL21（DE3）表达宿主中成功表达，分子量为67 kD。【结论】克隆获得的Aclac基因属于Cupredoxin超家族基因，可在原核表达系统中异源表达，推测其与其他真菌漆酶基因在生物学功能上具有一致性，丰富了真菌漆酶资源。

关键词： 玉木耳;漆酶基因;克隆;生物信息学;原核表达

中图分类号： S646.6                                文献标志码： A 文章编号：2095-1191（2021）08-2158-07

Cloning and prokaryotic expression analysis of laccase gene Aclac from Auricularia cornea

SU Wen-ying1， TAN Yi-luo1， LIU Xiao-mei1， YANG He-chuan1，

QIN Yu-ying1， LI Xiao2*， REN Li-kai1*

（1Lianyungang Academy of Agricultural Sciences，Lianyungang， Jiangsu  222006， China; 2Engineering Research Center of Chinese Ministry of Education for Edible and Medicinal Fungi， Jilin Agricultural University，

Changchun  130118， China）

Abstract：【Objective】 The cloning and prokaryotic expression analysis of the laccase gene （Aclac） of the Auricula-ria cornea provided a basis for in-depth study of the biological function of the laccase gene in the development of the fruit body of A.cornea. 【Method】Aclac gene of A.cornea was cloned，and the full-length cDNA sequence of the gene was obtained and analyzed by bioinformatics. The target gene was also ligated to the pET-28a plasmid to construct the prokaryo-tic expression vector pET28a-Aclac， and the recombinant plasmid was induced to express in Escherichia coli BL21 （DE3）. 【Result】The cloned Aclac gene cDNA sequence was 1734 bp long，encoded 577 amino acids，DNA sequence was 2521 bp，contained 14 introns，the theoretical AcLAC protein molecular weight was 64.75 kD，the isoelectric point was 5.70，the instability index was 34.01，there was no transmembrane region，and it contained a signal peptide.it was highly conserved in 4 copper ion binding regions， and contained the conservative functional domains of the Cupredoxin superfamily protein . The results of phylogenetic analysis showed that AcLAC protein and fungal laccase protein were clustered together. Among them， AcLAC protein had the closest relationship with the Auricularia. AcLAC fusion protein was successfully expressed in E. coli BL21（DE3）， and its molecular weight was 67 kD. 【Conclusion】The cloned Aclac gene belongs to the Cupredoxin superfamily gene and can be expressed heterologously in a prokaryotic expression system. It is speculated that it has the same biological function as other fungal laccase genes，and enriches fungal laccase resources.

Key words： Auricularia cornea; laccase gene; cloning; bioinformatics; prokaryotic expression

Foundation item：National Key Research and Development Program of China（2019YFD1001905-33）;Financial Grant Support Project of Lianyungang City（QNJJ1923）

0 引言

【研究意义】漆酶（Laccase，EC1.10.3.2）是一种含铜的多酚氧化酶，属于蓝色多铜氧化酶（MCO）家族成员。漆酶最早被日本学者Hikorokuro（1883）在紫胶漆树（Rhus verniciflua）分泌的汁液中发现，随后发现在真菌（Thurston，1994）、细菌（Roberts et al.，2002）和昆虫（Dittmer et al.，2004）中也广泛存在漆酶。其中，分泌漆酶的真菌主要有担子菌纲（Basidiomycetes）、子囊菌纲（Ascomycetes）、极少数半知菌纲（Deuteromycetes）及其他低等真菌（Gianfreda et al.，1999）。随着基因组测序技术的发展，已有大量的真菌漆酶基因被注释和研究，发现这些漆酶在食药用菌中发挥不同的功能，比如木质素降解、孢子萌发、色素合成、子实体形成和植物致病性等（Zhang et al.，2015）。玉木耳是毛木耳的白色变种，作为一类重要的白腐菌，其是目前所知最有效、最主要的木質素降解微生物。因此，对玉木耳漆酶基因克隆及表达分析，为丰富漆酶资源及探究玉木耳漆酶基因的生物学功能具有重要意义。【前人研究进展】近年来，许多真菌漆酶基因家族成员相继被克隆，并通过采用重组技术研究漆酶基因的同源、异源表达及调控机制。Ravalason（2009）将朱红密孔菌的漆酶基因lac1在黑曲霉中进行融合表达，研究发现重组漆酶菌株具有生物漂白功能，能使软木牛皮纸浆的漂白度达85% ISO。BAO等（2012）将果生链核盘菌的漆酶基因MfLCC2在毕赤酵母中进行诱导表达及体外表达，结果发现该重组漆酶菌株对三氯酚的降解率可达80%，故可作为处理三氯酚污染废水的候选菌株。Yang等（2012）研究发现漆酶基因lac5930-1在毕赤酵母中的表达可增加谷胱甘肽水平的抗氧化活性，提高酵母对H2O2介导的氧化应激，刺激谷胱甘肽的抗氧化系统，保护细胞免受氧化损伤的抵抗。裴佐蒂（2013）克隆获得灰盖鬼伞的漆酶基因CCLCC1Ⅰ，并在毕赤酵母中异源表达，研究发现重组漆酶菌株在发酵4 d后酶活力最高达890 mg/L，且在2，2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸二铵盐（ABTS）作为介体的情况下，对结晶紫和孔雀石绿的降解率分别达77.7%和79.2%。Wang等（2014）克隆获得Phomopsis liquidambari的漆酶基因lacB3，并在粟酒裂殖酵母中异源表达，将表达产物rLACB3施于种植花生的土壤中，结果发现花生中的香草醛含量增加12%，但土壤中香豆酸、对羟基苯和甲酸含量分别下降21%、27%和40%，表明该漆酶在促进花生生长中有很大潜力。郑苗苗等（2014，2015）通过对灰树花和红平菇中的漆酶基因进行异源表达，结果发现这些重组漆酶对含蒽醌类染料的废水处理具有很好的应用前景。Zhuo等（2015）从Ganoderma sp. En3中克隆获得漆酶基因lac-En3-1，并在毕赤酵母中异源表达，研究发现经重组漆酶处理20 h后，孔雀绿、溴苯诺尔兰、甲基橙和结晶紫的脱色率分别为94.1%、96.2%、80.2%和62.0%。郑邦晓等（2015）从一株齿毛菌中克隆获得漆酶基因Lac，并在毕赤酵母中异源表达，发现重组漆酶菌株在含1 mmol/L铜离子的YP培养基中28 ℃发酵15 d达最大酶活力（2.89 U/mL），且在乙酰丁香酮的帮助下，0.4 U/mL重组漆酶对靛类、偶氮类、三苯甲烷类等多种染料的脱色效果最佳。李杰等（2017）将凤尾菇的漆酶基因Lac4在黑曲霉CICC2462中进行异源表达，结果发现重组漆酶摇瓶发酵最高酶活为1211 U/L，在以ABTS作为介体的情况下可对中性红、甲基橙及孔雀绿染料发挥降解作用，脱色率分别为13%、11%和44%，而对活性亮蓝降解作用不明显。【本研究切入点】目前对毛木耳漆酶的研究主要集中在高产白腐菌菌株筛选、发酵优化及漆酶对木质素的生物降解等方面（杨建明等，2005;柏晓冉等，2020;徐安民等，2020）。原核表达系统具有培养周期短、成本相对低等特点，被广泛应用于各种重组蛋白表达。但鲜见玉木耳漆酶基因的克隆及原核表达分析的研究报道。【拟解决的关键问题】克隆玉木耳漆酶基因Aclac的cDNA和DNA全长序列，对其进行生物信息学分析，并构建原核表达载体pET28a-Aclac，将其转化大肠杆菌BL21（DE3）中诱导表达，以期丰富真菌漆酶资源，为深入研究Aclac基因在玉木耳生长过程中的表达情况及漆酶基因改良菌种打下理论基础。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

玉木耳菌丝由吉林农业大学食药用菌教育部工程研究中心提供。大肠杆菌（Escherichia coli）DH5α购自北京全式金生物技术有限公司。大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞和原核表达载体pET-28a由连云港市农业科学院保存。植物基因组DNA提取试剂盒购自北京康为世纪生物科技有限公司;UNlQ-10柱式TRIzol总RNA抽提试剂盒和IPTG购自上海生工生物工程股份有限公司;Peasy-T1克隆载体、TransStart FastPfu DNA聚合酶购自北京全式金生物技术有限公司;AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒杭州爱思进生物技术有限公司。RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit、EcoRⅠ和Not Ⅰ购自赛默飞世尔科技有限公司。MYG固体/液体培养基（葡萄糖10 g，麦芽糖5 g，酵母浸粉5 g，琼脂粉10 g，用ddH2O定容至1000 mL），121 ℃高压灭菌后用于复壮玉木耳菌丝。LB液体培养基（酵母提取物5 g，胰蛋白胨10 g，NaCl 10 g，用ddH2O定容至1000 mL），121 ℃高压灭菌后用于培养大肠杆菌。

1. 2 试验方法

1. 2. 1 基因组DNA提取 使用植物基因组DNA提取试剂盒提取玉木耳基因组DNA，具体操作步骤参照说明书进行，提取的DNA于-20 ℃保存备用。

1. 2. 2 总RNA提取及cDNA第一链合成 利用UNlQ-10柱式TRIzol总RNA提取试剂盒提取玉木耳总RNA，并用1%琼脂糖凝胶电泳及微量测定仪NanoDrop ND-1000对其浓度和纯度进行检测。检测合格后于-80 ℃保存备用。参照RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒说明书进行反转录合成cDNA第一链，于-20 ℃保存备用。

1. 2. 3 基因克隆 从玉木耳转录组数据库中筛选获得漆酶基因（Cluster-50942.6597）（杨和川等，2020），利用Primer Premier 5.0设计其扩增引物（Lcc-F：5?-ATGCGTTTCTCAACCAACG-3?;Lcc-R：5?-TTACAAGCCCGAATCATTCTTC-3?），委托金唯智生物技术有限责任公司合成。分别以玉木耳基因组DNA和cDNA为模板，利用引物Lcc-F和Lcc-R扩增Aclac基因的DNA和cDNA全长序列。PCR反应体系25.0 μL：5×TransStart FastPfu Buffer 5.0 μL，2.5 mmol/L dNTP Mix 2.0 μL，基因组DNA（或cDNA）模板4.0 μL，上、下游引物（Lcc-F和Lcc-R）各0.5 μL、TransStart FastPfu DNA聚合酶0.5 μL，用ddH2O补足至25.0 μL。扩增程序：95 ℃预变性2 min;95 ℃ 20 s，55 ℃ 20 s，72 ℃ 1 min，进行30个循环;72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。将PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后，利用AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒回收目的片段。

1. 2. 4 载体构建及转化 将目的片段与Peasy-T1克隆载体连接。连接反应体系：Peasy-T1克隆载体1.0 μL，回收产物4 μL。反应条件为25 ℃，20 min。利用热激法将重组克隆载体转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布平板，37 ℃过夜培养，挑取单菌落接种于5 mL LB液体培养基（含氨苄青霉素），37 ℃下200 r/min震荡培养过夜。经菌液PCR鉴定后，挑取阳性克隆送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行测序。

1. 2. 5 基因序列分析 利用DNAMAN 8.0将测序结果与参考序列（Cluster-50942.6597）进行比对分析;通过NCBI CDD对蛋白的保守功能域进行预测。运用PredictProtein对蛋白的二级结构进行预测;运用ProtParam对蛋白理化性质进行预测;运用TMpred预测蛋白的跨膜区;运用SignalP 5.0预测信号肽;运用SWISS-MODEL在线工具对蛋白的三级结构进行建模;从NCBI中搜索下载有代表性的细菌及真菌漆酶蛋白的氨基酸序列，并利用MEGA 5.10的邻接法（Neighbor-joining，NJ）构建系统发育进化树。

1. 2. 6 原核表达及SDS-PAGE检测 用限制性内切酶EcoR Ⅰ和Not Ⅰ分别酶切表达载体pET-28a和Aclac基因，利用凝胶回收试剂盒纯化回收酶切产物后进行同源重组连接。将重组表达载体pET28a-Aclac转化宿主菌大肠杆菌BL21（DE3），涂布至含100 μg/mL卡那霉素的抗性平板，挑取阳性菌落至5 mL LB液体培养基（含100 μg/mL卡那霉素）中，37 ℃ 180 r/min在恒温摇床中震荡培养过夜;次日将过夜培养物转接至含100 μg/mL卡那霉素LB液体培养基中，37 ℃ 180 r/min震荡培养3 h，至OD600值达0.6～0.7;加入终浓度为1 mmol/L的IPTG，20 ℃条件下，180 r/min诱导表达16 h，37 ℃培养4 h，离心收集菌体。利用PBS缓冲液重悬菌体后，通过超声破碎法（超声1 s，停3 s，共10 min）破碎菌体，经12000 r/min离心后分离上清液和沉淀。利用SDS-PAGE电泳检测AcLAC蛋白的表达情况。

2 结果与分析

2. 1 基因克隆结果

分别以玉木耳基因组DNA和cDNA为模板扩增获得Aclac基因的DNA和cDNA全长序列，长度约2500和1800 bp，与预期大小基本相符（图1）。利用DNAMAN 8.0对Aclac基因DNA和cDNA全长序列的测序结果进行比对分析，结果表明，克隆获得的Aclac基因cDNA序列长度为1734 bp，编码577个氨基酸残基;Aclac基因DNA序列长度为2521 bp，含14个内含子。

2. 2 生物信息学分析结果

NCBI的CDD预测结果显示，AcLAC蛋白含有Cupredoxin超家族蛋白保守功能域，表明Aclac基因属于Cupredoxin超家族基因（图2）。ProtParam预测结果显示，AcLAC蛋白的分子量为64.75 kD，理论等电点为5.70;在体外半衰期为30 h，不稳定指数为34.01，表明该蛋白较稳定。PredictProtein预测结果显示AcLAC蛋白的氨基酸组成如图3-A所示，以亮氨酸数量最多，半胱氨酸数量最少。通过SWISS-MODEL对AcLAC蛋白的三级结构预测结果如图3-B所示。TMpred预测结果（图4和图5）显示，AcLAC蛋白不存在跨膜区，但存在1个信号肽结构。

由图6可知，细菌的漆酶蛋白聚为一支;AcLAC蛋白与真菌的漆酶蛋白聚为一支，其中AcLAC蛋白与木耳属真菌的漆酶蛋白亲缘关系最近。将AcLAC蛋白与黑木耳的漆酶蛋白和lcc5序列进行多序列比对分析，结果发现AcLAC蛋白在铜离子结合区高度保守（图7）。

2. 3 原核表达结果

将重组表达载体pET28a-Aclac进行双酶切验证，结果（图8）显示目的基因成功连接至pET-28a质粒上。对Aclac基因在大肠杆菌BL21（DE3）表达宿主中进行异源表达，SDS-PAGE检测结果（图9）显示，AcLAC融合蛋白成功表达，分子量约为67 kD，与预期结果相符。

3 討论

漆酶是木质素合成的关键酶之一，其中，真菌漆酶研究最广泛和深入，目前已在60多种真菌中发现了漆酶，且确定其具有漆酶活性。本研究将克隆获得的Aclac基因在NCBI进行多序列比对分析，发现该基因与其他真菌漆酶基因序列同源性不高。前人研究也表明，真菌漆酶的来源很多，但整体的漆酶基因序列同源性并不高，如担子菌与子囊菌漆酶的序列相似性仅为20%～30%，但不同漆酶中铜离子结合区域相对保守（Kumar et al.，2003）。此外，漆酶基因中含有相当多的内含子，其中一些也高度保守（Colao et al.，2003）。Kumar等（2003）对60多个真菌漆酶蛋白序列进行比对分析，结果发现漆酶蛋白包含4个保守区域，且这4个保守区域为漆酶蛋白的特征序列。本研究将获得的AcLAC蛋白序列与GenBank中登录的其他真菌漆酶蛋白序列进行比对，发现AcLAC蛋白序列中含有4个保守的铜离子结合区，推测不同真菌的漆酶基因在生物学功能上具有一致性。

毛木耳是一类重要的白腐菌。白腐菌是目前所知最有效、最主要的木质素降解微生物，在工业生产中有广泛的应用价值。通过对毛木耳产漆酶基因进行异源表达，获得分泌高活性漆酶的重组菌，可为木质素酶在生产实践上的应用提供理论参考。杨建明等（2008）利用PCR和RACE技术首次从毛木耳中克隆获得1个新漆酶基因的cDNA和DNA全长序列，并在毕赤酵母中进行异源表达。本研究为深入探究玉木耳漆酶基因的生物学功能，从玉木耳中克隆获得漆酶基因Aclac，并构建其原核表达载体，通过原核表达系统对Aclac基因进行异源表达。但潘程远（2009）研究发现，利用原核表达系统表达漆酶蛋白时，未检测到活性，可能是因为漆酶是一种高糖基化修饰的酶，而原核表达系统不具备对重组蛋白进行二级结构修饰的能力，故获得的重组蛋白不具有漆酶活性。此外，漆酶的应用方面存在表达困难、热稳定性和pH耐受性较差及酶活力较低等问题，国内外学者则通过优化启动子、信号肽及提高基因表达量和酶活力（Garg et al.，2012;Kristiina et al.，2013;Lin et al.，2013）解决这些问题。本研究仅初步对玉木耳漆酶基因进行异源表达，如何实现漆酶的高效异源表达及获得高酶活力的漆酶有待深入研究。

4 结论

克隆获得的Aclac基因属于Cupredoxin超家族基因，可在原核表达系统中异源表达，推测其与其他真菌漆酶基因在生物学功能上具有一致性，丰富了真菌漆酶资源。

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（責任编辑 陈 燕）

收稿日期：2020-09-18

基金项目：国家重点研发计划项目（2019YFD1001905-33）;连云港市财政专项（QNJJ1923）

通讯作者：李晓（1976-），https：//orcid.org/0000-0003-0657-4673，副教授，主要从事食用菌教学、科研和产业化开发研究工作，E-mail：lxmogu@163.com;任立凯（1981-），https：//orcid.org/0000-0002-9409-8840，副研究员，从事作物遗传育种研究工作，E-mail：2949823@qq.com

第一作者：苏文英（1992-），https：//orcid.org/0000-0002-4687-2854，主要从事食用菌遗传育种研究工作，E-mail：18004425758@163.com