白桦脂醛对裸鼠移植瘤生长的抑制作用及机制研究

黄攀豪，汤紫照，聂方钦，符阳霞，晏欣，李岱，郭韧

（1.中南大学湘雅三医院药学部，湖南长沙410013；2.中南大学湘雅医院I期临床试验中心，湖南长沙410008）

中国传统医药及其在临床疾病中的应用为提高全世界人民的健康水平做出了巨大贡献。近几十年来，青蒿素在治疗疟疾、三氧化二砷在治疗白血病等方面取得的重大成就，证实了中国传统中医药的发展前景[1-2]。在前期的筛查研究中，笔者提取了部分中药单体有效成分，并通过高通量筛选技术筛选出了一些具有明显抗癌活性的中药提取物，其中筛选出的提取物白桦脂醛对A549 细胞活性展现出了较大的抑制作用。笔者通过网络药理学方法筛选白桦脂醛作用于肺癌的靶点时，发现EGFR 是其潜在靶点，而EGFR 可调控Raf/MEK/ERK 和PI3K/Akt/mTOR 等通路，起到调节肿瘤细胞增值、分化和侵袭转移的作用；IL-6/JAK/STAT3 也是EGFR 下游的重要信号传导途径，在调节肿瘤细胞增殖过程中起重要作用。因此，笔者猜想白桦脂醛白桦脂醛的抑瘤作用可能和Akt、ERK、STAT3 通路有关。由于自噬在肿瘤进展中起着重要的作用，故白桦脂醛也有可能通过调节A549 细胞的自噬水平发挥抑瘤作用。因此，本研究拟通过运用裸鼠皮下成瘤实验进一步在整体动物上观察白桦脂醛的抑瘤作用，并通过分子生物学实验手段确定白桦脂醛抑瘤作用可能的机制。

1 材料与方法

1.1 药品与试剂

白桦脂醛购美国MCE 公司， 分子式为C30H48O2，分子量440.70，纯度= 98.56%；TUNEL 试剂盒 （KGA704） 购自凯基生物 （KeyGEN BioTECH）；苏木素伊红（HE） 染色试剂盒购自Wellbio 公司；抗Akt、磷酸化AKT （P-Akt）、抗ERK、抗STAT3、抗LC3、抗p62、抗actin 抗体购自美国Proteintech 公司；磷酸化ERK （P-ERK） 和磷酸化STAT3 （P-STAT3） 抗体购自英国Abcam 公司；DMEM（含4 500 mg/L D-葡萄糖）培养基和胎牛血清购自美国Sigma 公司。

1.2 实验细胞和动物

人非小细胞肺癌细胞A549 购自上海中乔新舟公司，培养于DMEM 高糖培基含10%胎牛血清，置37 ℃恒温含5%CO2培养箱中培养。4 周龄SPF 级雄性裸鼠，12～15 g，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，动物许可证号：SYXK （湘） 2020-0019。

1.3 实验方法

1.3.1 成瘤模型的建立和分组给药 白桦脂醛溶解于DMSO 配置成20 mg/mL 储备液。适应性喂养1 周后，按2×106个/100 μL 人非小细胞肺癌细胞A549通过腋下皮下注射植入裸鼠，待瘤体生长到合适大小，随机分成4 组，每组7 只裸鼠，分别为对照组（DMSO），白桦脂醛低剂量组（50 mg/kg），中剂量组（100 mg/kg），白桦脂醛高剂量组（200 mg/kg），腹腔注射给药干预持续1 周，1 次/d。

1.3.2 肿瘤生长曲线和抑瘤率测定 成瘤后每周进行2 次瘤体测量，肿瘤大小用用游标卡尺测定长轴（A） 和短轴（B） 计算，计算公式为V （cm3） =A×B2/2。种瘤21 d 后，采用颈椎脱臼处死裸鼠。

1.3.3 HE 染色 烤片，二甲苯脱蜡；梯度浓度的乙醇中复水；用苏木素染细胞核，蒸馏水冲洗后用PBS 返蓝；伊红染染细胞核，蒸馏水冲洗，再用梯度酒精脱水，取出后置于二甲苯；中性树胶封片，用光学显微镜观察阳性细胞。

1.3.4 TUNEL 染色 烘片，二甲苯脱蜡，梯度乙醇水合；高碘酸封闭后依次加Proteinase K 工作液、内源性亲和素封闭A 液和内源性生物素封闭B 液孵育，再加TdT 酶反应液和Streptavidin-HRP 标记液和DAB 工作液反应，漂洗后加苏木素染液染色；1%盐酸甲醇中分化；梯度无水乙醇脱水，晾干后加中性树胶和盖玻片，用光学显微镜观察拍照TUNEL 阳性细胞。

1.3.5 Western blot 检测蛋白表达水平 取各组肿瘤组织加RIPA 裂解，提取组织总蛋白；取蛋白上清，蛋白定量；10%SDS-PAGE 凝胶电泳分离蛋白，转膜，5%脱脂奶粉室温封闭，依次加一抗和二抗孵育；ECL 化学发光液与膜孵育，用塑封膜将膜包裹杂交膜，在暗盒内与X 胶片曝光，显影冲洗；扫描底片，用Quantity one 软件统计灰度值计算相对表达量。

1.4 统计学处理

实验数据采用SPSS 24.0 软件（IBM，USA）进行统计分析，多组间比较采用方差分析，进一步多组内两两比较采用LSD 检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 裸鼠成瘤实验结果

裸鼠成瘤实验显示，各组小鼠接种A549 细胞3 周后，接种部位均出现明显肿瘤。于第3 周实验结束时，各组裸鼠移植瘤情况见图1；不同剂量的白桦脂醛均可一定程度地减慢移植瘤的生长，并呈一定的剂量依赖性，3 周后，中、高剂量白桦脂醛处理组移植瘤体积与对照组的差异有统计学意义[（0.33±2.57）cm3vs.（0.53±0.10）cm3；（0.24±5.42）cm3vs.（0.53±0.10）cm3，均P＜0.01]，而低剂量白桦脂醛处理组移植瘤体积与对照组间差异无统计学意义[（0.43±1.70）cm3vs.（0.53±0.10）cm3，P＞0.05]（图2）。

图1 各组裸鼠移植瘤生长情况

图2 各组移植瘤体积变化曲线

2.2 移植瘤组织病理情况比较

各组裸鼠移植瘤呈圆形、椭圆形或分叶状包块，包膜完整，与周围组织分界清楚。HE 染色后显微镜下可观察到不同白桦脂醛剂量组小鼠瘤体组织呈现出不同程度的退行性病变，部分区域出现明显细胞坏死区，在高剂量白桦脂醛处理组较为明显。对照组肿瘤细胞生长旺盛，大小不一，有一定异型性，细胞核较大，瘤体组织未见明显坏死（图3）。

图3 各组瘤体组织HE染色情况（×100）

2.3 各组瘤体组织细胞增凋亡平比较

使用TUNEL 染色检测了肿瘤组织中细胞的凋亡比例，结果显示，不同剂量的白桦脂醛处理成瘤小鼠后，使瘤体组织中TUNEL 染色阳性细胞数明显增加，并且呈剂量依赖性，差异有统计学意义（P＜0.01）（图4）。

图4 各组瘤体组织TUNEL染色结果（×100）

2.4 白桦脂醛对肿瘤组织细胞内增殖信号通路的影响

通过Western blot 法检测白桦脂醛给药后对瘤体组织细胞中Akt、ERK、STAT 信号通路的变化，结果发现白桦脂醛可呈剂量依赖性地抑制Akt、ERK、STAT 信号通路的活化，表现为p-Akt、p-ERK、p-STAT3 表达的明显下调，差异均有统计学意义（均P＜0.05）（图5）。

图5 白桦脂醛对细胞内增殖信号通路相关蛋白水平的影响

2.5 白桦脂醛对肿瘤组织自噬水平的影响

本研究还观察了白桦脂醛对瘤体组织的自噬水平的影响，结果显示，白桦脂醛可呈剂量依赖性地提升瘤体组织的自噬水平，表现为p62 表达的降低及LC3 II/I 水平的升高，差异均有统计学意义（均P＜0.05）（图6）。

图6 白桦脂醛对自噬相关蛋白水平的影响

3 讨论

以往对白桦脂醛作用的研究较少。Chung 等[3]研究表明，白桦脂醛作为一种FtsZ 蛋白抑制剂，能快速抑制金黄色葡萄球菌的生长，发挥杀菌作用，并与其他抗菌药物具有协同作用。此外，有研究[4-5]表明白桦脂醛作为桦木属植物提取物具有一定的血糖调节能力。Yang 等[6]也发现白桦脂醛是一种天然的RORγt 激动剂，可通过直接与蛋白质结合改变RORγt 的热稳定性。RORγt 的激动剂和抑制剂分别是潜在的肿瘤免疫治疗药物和自身免疫性疾病药物，提示白桦脂醛可能具有一定的免疫调节作用[7-8]。由于肿瘤细胞较正常细胞表现出特异的代谢活性（偏向于以糖酵解和脂代谢方式供能）和免疫活性，因此白桦脂醛可能通过对代谢和免疫的调节发挥抗肿瘤作用。然而，关于白桦脂醛抗肿瘤作用的实验数据却未见报道。本研究在前期高通量筛选数据的基础上，通过裸鼠皮下成瘤实验在整体动物上进一步验证了白桦脂醛的抑瘤作用，并通过分子生物学技术确定了其主要参与的分子信号通路。

A549 细胞是一种常用的非小细胞肺癌细胞株，常用于抗肿瘤药物的药筛和药敏实验，本研究中将其接种于裸鼠皮下1 周后，成瘤率达到了100%，所有接种个体均形成了大小不等的种植瘤。本实验中设置了低、中、高剂量的白桦脂醛给药组，结果显示白桦脂醛可明显降低成瘤小鼠最终的瘤体体积，提示了白桦脂醛在整体动物水平能抑制肿瘤细胞的生长。确定了白桦脂醛抑制肿瘤细胞生长的作用后，进一步对不同处理组的瘤体组织进行了病理学检查。瘤体组织HE 染色结果显示不同剂量给药的裸鼠移植瘤镜下呈现不同程度片状坏死区，坏死区肿瘤细胞结构模糊，细胞核裂解消失，坏死灶周边有少量残存的肿瘤细胞。这一结果提示，白桦脂醛对瘤体组织A549 细胞的活性有明显的抑制作用。

为了进一步确定白桦脂醛对瘤体组织细胞生长活性的影响，研究中还使用TUNEL 染色检查了瘤体组织处于凋亡状态的细胞数量，与白桦脂醛的抑瘤作用一致，白桦脂醛处理后瘤体组织中凋亡细胞数明显增加，表明白桦脂醛通过对A549 细胞内信号通路的调节，打破了细胞原有的凋亡状态的平衡，使细胞趋向于凋亡。肿瘤细胞与正常细胞相比，其胞内促存活信号通路明显活化，主要包括Akt、ERK、STAT 等信号通路的活化[9-11]。本研究中运用Western blot 的方法检测了白桦脂醛给药后对瘤体组织细胞中Akt、ERK、STAT 信号通路的影响，结果发现白桦脂醛可呈剂量依赖性地抑制Akt、ERK、STAT 信号通路的活化，表明白桦脂醛可通过对多条分子信号通路的影响发挥抑瘤作用。既往的研究证实了异常的自噬水平参与了肿瘤疾病的发生发展，但关于自噬在肿瘤疾病中是起到抑制还是促进的作用，有很多相互矛盾的报道[12-13]。本研究中另一重要发现是白桦脂醛的抑瘤作用可能与自噬有关，白桦脂醛可明显上调瘤体组织细胞中的自噬水平。由于自噬水平的高低对细胞的代谢和能量供应均有密切关系，因此白桦脂醛的抑瘤作用也可能与其对自噬的调节有一定关系，未来需要更进一步的机制实验以证明这一关系。

总之，本研究通过裸鼠皮下种瘤实验初步证实了一种具有显著药理学活性的植物提取物白桦脂醛，能够显著抑制裸鼠皮下移植瘤的生长，降低A549 细胞的成瘤能力，其机制可能与对种瘤细胞内多条促增殖信号通路的抑制有关。白桦脂醛抑瘤作用的发掘可能为今后临床治疗肺癌及其他恶性肿瘤提供一定的思路。