雄激素受体基因rs5918762位点多态性与前列腺癌的关系▲

杨建荣 凌凯南 李碧锦 李 军 季志强 刘菊珍

(广西壮族自治区江滨医院泌尿外科，南宁市 530021，电子邮箱：13907869384@139.com)

前列腺癌是男性生殖系统最常见的恶性肿瘤，其发病率具有明显地区差异，而近年来中国前列腺癌的发病率呈明显上升趋势[1]。研究表明，前列腺癌的发生可能与遗传、环境、性激素等有关[2]，其中遗传因素在前列腺癌的发生中具有重要作用[3]。此外，前列腺上皮细胞的生长对雄激素具有依赖性，而雄激素的活性主要由雄激素受体(androgen receptor，AR)调控[4]。因此，AR在前列腺癌的发生中也扮演着重要角色。

单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)是指在基因组水平上单个核苷酸的变异而形成的遗传标记，其可以调控基因表达,引起蛋白功能变化。目前，AR基因的SNP位点与前列腺癌之间关系的研究报道较少。故我们筛选AR相关SNP位点后，采用高分辨率溶解曲线分析技术检测前列腺癌患者与健康体检者AR基因rs5918762位点的基因型，并使用第一代测序Sanger法进行验证，为阐明AR基因位点rs5918762多态性与前列腺癌的关系提供理论参考。

1 资料和方法

1.1 临床资料 选取2015年1月至2019年1月期间就诊于广西江滨医院泌尿外科和广西医科大学第一附属医院泌尿外科的85例前列腺癌患者作为前列腺癌组。纳入标准：常居广西5年以上；均经过两名以上病理科高年资病理医师阅片证实为前列腺癌；初治患者，未经放疗或化疗。排除标准：患有其他肿瘤疾病或合并严重心肺等严重疾病者；有严重并发症或资料严重缺失者。另从这两家医院体检中心纳入85例同期健康体检者(男性)作为正常对照组。纳入标准：常居广西5年以上；与前列腺癌组患者无遗传学关联性。排除标准：患有其他肿瘤疾病或合并严重心肺等严重疾病者；血清前列腺特异抗原(prostate specific antigen，PSA)>4 μg/L者。所有受试者均签署知情同意书，本研究经广西江滨医院伦理委员会审批。

1.2 资料收集 收集两组研究对象的年龄、体质指数、居住地、血清PSA水平，以及前列腺癌患者的临床分期、前列腺组织Gleason分级(根据世界卫生组织最新标准[5]进行评估)等资料。

1.3 AR基因SNP位点的选择策略 使用NCBI 的dbSNP数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/)与SNPinfo数据库(https://manticore.niehs.nih.gov/)筛选AR相关的SNP位点。筛选条件：(1)HapMap中中国人群中最小等位基因频率≥5%；(2)多态位点位于3′UTR区 ；(3)多态位点之间连锁不平衡分析提示r2<0.8；(4)位点尚无前列腺癌相关研究和全基因组关联性研究报告该位点；(5)在NCBI收录文献中有引用该位点。最终仅rs5918762位点符合要求。

1.4 标本收集与DNA提取 抽取研究对象清晨空腹肘静脉血3～5 mL，采用乙二胺四乙酸抗凝后置于-80℃冰箱长期保存待用。采用天根生化科技(北京)有限公司DNA提取试剂盒(批号：OSR-M102)提取全血基因组DNA，进行1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，采用紫外分光光度计(日本岛津公司，型号：UV-2450)测定260 nm波长的吸光度值，以测定DNA浓度。

1.5 PCR扩增 在NCBI数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)中搜索AR基因(NM_001348064.1:c.)转录本附近序列，然后在NCBI primer-BLAST(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi)输入FASTA序列，选择覆盖rs5918762位点的引物，得到上游引物(GTGAGGACGGGCTGTAGAAG)和下游引物(GTGAGGACGGGCTGTAGAAG)，扩增片段长度198 bp，引物由广西吉娃娃生物科技有限公司合成。PCR试剂盒购自TaKaRa公司(批号：DRR036A)，根据说明书进行反应体系的配置，反应体系包括SYBR Green Ⅰ mix(2×)5 μL、上游引物(10 μmol/L)0.3 μL、下游引物(10 μmol/L)0.3 μL、cDNA 0.4 μL，灭菌蒸馏水加至10 μL。PCR反应循环条件：95℃预变性5 min，95℃ 30 s，54℃ 30 s，72℃ 40 s，共35个循环；最后72℃ 10 min，4℃保存至取出产物。PCR产物用2%琼脂糖凝胶电泳鉴定后，置于-20℃冰箱中保存。

1.6 高分辨熔解曲线分析技术检测AR基因rs5918762位点基因型 将9 μL PCR产物与1 μL饱和荧光染料(美国Idaho公司，批号：1000rnx)于暗室中依次加入96孔PCR板并混匀，加入1滴矿物油封液面；PCR反应：95℃ 30 s，25℃ 30 s，共1个循环，保持4℃；将96孔板4 000 r/min离心30 min后，放入LightScanner 384高分辨率溶解曲线突变检测/基因分型分析系统(美国Idaho公司)中，分析溶解曲线，得出rs5918762位点基因型，并与酶切结果相互佐证。AR基因rs5918762位点基因型如图1，其中红色曲线代表基因型TT，绿色和蓝色曲线分别代表基因型CT和CC。

图1 AR基因rs5918762各基因型溶解曲线

1.7 一代测序Sanger法验证 使用PCR产物纯化试剂盒(德国QIAGEN公司，批号：28106)纯化每个样本的PCR扩增产物，链接到pUC19克隆载体(购自上海吉凯基因生物科技有限公司)上，转化到感受态大肠杆菌进行扩增，并常温培养24 h；经过蓝白斑法筛选后挑选8个阳性克隆菌斑进行摇菌培养(溶菌肉汤培养基+50 mg/mL氨苄霉素，37℃烘箱培养15 h)后提取质粒DNA，并委托上海生工生物工程有限公司进行Sanger测序，通过NCBI数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)进行序列比对分析。

1.8 统计学分析 使用SPSS 17.0软件进行统计分析。计量资料以(x±s)表示；计数资料以例数(百分比)表示，组间比较采用χ2检验；采用拟合优度检验对各组基因进行Hardy-Weinberg平衡检验；采用Logistic回归分析计算各基因型人群患前列腺风险的比值比(odds ratio,OR)及95%CI。以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 研究人群的特征 两组研究对象的年龄、体质指数、居住地差异均无统计学意义(均P>0.05)，具有可比性，见表1。85例前列腺癌患者行血清PSA检测，为(49.96±3.99)μg/mL，正常对照组血清PSA水平为(2.29±0.07)μg/mL。前列腺癌患者临床分期Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期分别有4例(4.71%)、41例(48.24%)、21例(24.70%)、19例(22.35%)；Gleason评分≤7分、>7分各32例(37.65%)、51例(60.00%)，2例患者缺失记录。

表1 两组研究对象基线资料的比较[n(%)]

2.2 两组研究对象AR基因rs5918762位点基因型分布频率的比较 在两组样本中均检测到位点变化。两组研究对象在AR基因rs5918762位点上均以TT基因型为主(见表2)，与一代测序Sanger法检测结果一致。Hardy-Weinberg平衡检验显示两组的P值均>0.05，说明群体基因遗传平衡，数据来自同一群体，具有人群代表性，见表2。

两组研究对象AR基因rs5918762位点基因型分布频率差异有统计学意义(χ2=14.155，P<0.001)，其中前列腺癌组AR基因rs5918762位点TC基因型与CC基因型比例均高于正常对照组，而TT基因型比例低于对照组，见表3。与携带AR基因rs5918762位点TT基因型者相比，携带AR基因rs5918762位点CC基因型者[OR=8.377，95%CI(1.286，9.729)，P=0.023]、TC基因型者[OR=3.630，95%CI(1.663,7.967，P=0.001)]患前列腺癌的风险增加。

表2 Hardy-Weinberg平衡检验[n(%)]

表3 两组研究对象AR基因rs5918762位点基因型分布频率的比较[n(%)]

2.3 AR基因rs5918762位点不同基因型前列腺癌患者的临床病理特征的比较 3种基因型的前列腺患者的血清PSA水平、Gleason评分差异均无统计学意义(均P>0.05)。与携带TT基因型患者相比，携带CC基因型患者的临床分期Ⅲ～Ⅳ期比例更高(均P<0.05)，见表4。

表4 AR基因rs5918762位点不同基因型前列腺癌患者的临床病理特征的比较[n(%)]

3 讨 论

编码人类AR的基因定位于X染色体的长臂q11-12，由919个氨基酸组成，含有8个外显子和7个内含子，相对分子量约为111 000[6]。目前有关AR基因多态性与前列腺癌的相关性研究中，AR基因多态性位点主要包括位于第一外显子区的(CAG)n和(GGN)n三核苷酸重复序列STR位点以及SNP位点[7]。目前多数学者认为，基因多态性可能通过影响AR的表达水平及转录活性，从而影响雄激素作用的信号传导通路，以刺激前列腺上皮细胞的过度增生，进而促进前列腺癌的发生和发展[8-9]。研究表明， AR基因E211G>A多态性与转移性前列腺癌和雄激素性脱发的发生风险降低相关[10]。还有学者通过生信分析33个前列腺癌风险位点后发现，有1/3的SNP风险区域位于AR结合区域[11]。还有研究显示，前列腺癌细胞的AR转录活性明显增强，T877A基因突变导致AR转录活性增强是去势抵抗性前列腺癌发生的机制之一[12-13]。以上研究表明，AR基因多个位点的多态性可能参与前列腺癌的发生、发展，但还需要分子生物学实验进一步验证。

本研究分析了AR基因rs5918762位点多态性与前列腺癌风险之间的关系，发现与正常对照组相比，前列腺癌组AR基因rs5918762位点TC基因型与CC基因型比例更高，而TT基因型比例更低(P<0.05)；与携带AR基因rs5918762位点TT基因型相比，携带AR基因rs5918762位点CC基因型、TC基因型的人群患前列腺癌的风险增加(均OR>1，P<0.05)。这提示AR基因rs5918762位点基因多态性可能与前列腺癌的发病有关，其中携带CC基因型、TC基因型的人群患病概率增加。此外，与携带AR基因rs5918762位点TT基因型相比，携带AR基因rs5918762位点CC基因型的前列腺癌患者临床分期Ⅲ～Ⅳ期比例更高(均P<0.05)，这提示AR基因rs5918762位点基因多态性可能还与前列腺癌的病情发展有关，携带AR基因rs5918762位点CC基因型、TC基因型的前列腺癌患者的病情进展更快，可能预后亦相对更差。

本研究存在一些不足之处：(1)本文的研究对象仅来源于两家医院，样本较少，且为回顾性研究，今后需要开展多中心、大样本的前瞻性研究，以获得更为确切、普适性更强的结论；(2)前列腺癌发病是多因素共同作用的结果，1个基因的SNP可能无法完全解释疾病状况，只能作为辅助诊断的依据，在今后的研究中应纳入多因素综合分析前列腺癌的发病影响因素。国际“千人基因组计划”研究结果显示，在东亚和南亚人群中，AR基因rs5918762位点的C等位基因频率分别为0.997和0.908，T等位基因频率分别为0.003和0.092(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/variation/tools/1000genomes/)，由此可见CC基因型在亚洲人群更常见，与本研究结果相反；此外，本研究结果显示，Gleason评分在AR基因rs5918762位点的TC或CC基因型与TT基因型患者之间不存在差异，这些可能也是上述因素所致。因此，AR基因rs5918762位点在前列腺癌发生和发展中的具体意义，还需要多中心大样本研究一步证实，而其影响机制也还需要进一步分子生物学实验验证。

总之，AR基因rs5918762位点的多态性可能与前列腺癌易感性和疾病发展有关，且携带AR基因rs5918762位点的CC或TC基因型者前列腺癌易感性增加，携带CC基因型的前列腺癌患者疾病进展可能更快。