FOXO 基因对印楝素诱导sf9 细胞凋亡的影响

邵雪花，赖 多，匡石滋

（广东省农业科学院果树研究所/农业农村部南亚热带果树生物学与遗传资源利用重点实验室/广东省热带亚热带果树研究重点实验室，广东 广州 510640）

【研究意义】印楝素（azadirachtin,AZA）作为植物源杀虫剂的典型代表，可抑制多种害虫的生长发育，已被广泛应用到害虫防制中［1］。草地贪夜蛾是农业生产中的重要害虫［2］，也是对印楝素最为敏感的害虫之一。研究表明，对FOXO基因是调控昆虫生长发育的关键转录因子［3］，但该基因如何调控印楝素所诱导的昆虫细胞凋亡却未见报道，这在一定程度上制约了印楝素的科学使用。【前人研究进展】印楝素是从印楝树（Azadirachta indicaA.Juss）的种子、叶子和其他部分中分离出来的柠檬苦素类化合物，几十年来一直在害虫综合治理中用作拒食剂和害虫生长调节剂［4］。AZA 被认为是最有效生物农药之一，最适合于商品化开发的植物源杀虫剂［5-7］。草地贪夜蛾（Spodoptera frugiperda）是起源于美洲大陆的一种跨国界迁飞性农业重大害虫，具有繁殖能力强、迁飞扩散快和防控难度大等特点［8-10］。其寄主范围广，幼虫可取食禾本科、菊科、豆科和苋菜科等76 科353 种植物，给生产带来巨大威胁［11］。前人研究表明，AZA 可以诱导粉纹夜蛾（Cabbage looperHi-5）、斜纹夜蛾（Spodoptera lituraSL-1）和 草地贪夜蛾（Spdoptera frugiperdasf9）等多种昆虫细胞凋亡，进而抑制细胞增殖［12-14］。此外，AZA 已被证明可激活癌细胞中的多种凋亡信号通路，如受体通路、AIF 介导通路、ROS 依赖性、p38 和JNK1/2 通路以及MAPK通路［15-16］。细胞凋亡（Apoptosis）又称程序性细胞死亡（Programmed cell death，PCD），是一种特殊的细胞死亡方式，是为维持内环境稳定，由基因控制的细胞自主有序的主动死亡过程［17］。当细胞凋亡调控失衡时，可引起细胞过度增殖或过度凋亡，导致细胞死亡和相关疾病的发生［18］。FOXO基因作用广泛，参与调控生长、抗肿瘤、细胞分化、新陈代谢及细胞凋亡等多种过程［19］。FOXO 不仅可调控幼虫的生长发育，还能通过胰岛素受体InR对胰岛素信号通路进行反馈调节［20］。【本研究切入点】我们之前的研究表明AZA 可通过溶酶体释放组织蛋白酶而诱导中肠细胞凋亡［21］，FOXO基因位于溶酶体信号通路的上游，可参与调控凋亡信号的转导通路，那么该基因是如何调控印楝素诱导的昆虫细胞凋亡呢？本研究从转录因子FOXO出发，结合细胞生物学、分子生物学等技术手段，研究FOXO基因在印楝素诱导sf9 细胞凋亡中的作用。【拟解决的关键问题】本研究以印楝素和草地贪夜蛾卵巢细胞为研究对象，探讨印楝素通过FOXO转录因子调控sf9 细胞的增殖和凋亡的作用机理，为探索印楝素分子机制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

药物及试剂：草地贪夜蛾卵巢细胞sf9（C0004）购自于深圳市百恩生物科技有限公司，印楝素（A115081）购于上海晶纯生化科技股份有限公司，SFM（12682-019）购于赛默飞世尔科技公司，小牛血清（11011-8611）购自于杭州四季青生物工程材料有限公司，Phospho-FOXO（#84192）、Cleaved Caspase-3（#9661）、Bim（#2933）均购自Cell signaling 公司，小鼠单克隆抗体，HRP 标记的山羊抗小鼠IgG（D110087）购自生工生物工程（上海）股份有限公司，HRP 标记羊抗兔IgG（#A0208）购自碧云天生物技术有限公司，ECL 显色试剂盒（#1705060）购自Bio-Rad 公司，BCA 定量试剂盒（#PA115）购自于天根生化科技（北京）有限公司。

细胞培养：将复苏后稳定生长的sf9 细胞置于培养基中，加入含有10%小牛血清的SFX，在27 ℃细胞培养箱中孵育，传代至对数生长期的细胞用于后续实验。

1.2 CCK-8 法检测细胞增殖

将传代至对数生长期的sf9 细胞悬浮液（100～500 CFU/μL）接种到96 孔板（100 μL/孔）中。待细胞贴壁后，吸弃培养基，加入不同浓度的AZA 培养液，设置AZA 0.625、1.25、2.5、5.0、10.0、20、40、80 mmol/L 8 个浓度处理，另设细胞对照和溶剂对照（1‰ DMSO），27 ℃孵育48 h，向各孔加入10 μL CCK-8 溶液，继续孵育3 h，于450 nm 处测定吸光度。每个浓度设置8 个重复孔，并取每组中3 次实验的平均值，计算细胞活力:

式中，A加药为含有细胞、CCK-8 和AZA 的孔内OD 值，A空白为只含CCK-8、不含细胞和AZA 的孔内OD 值，A零加药为含细胞、CCK-8 不含AZA的孔内OD 值。

1.3 透射电镜观察sf9 细胞

5 mmol/L AZA 分别作用于细胞24、48、72 h，对照加入1‰ DMSO 细胞培养液，每隔2 d 重新更换培养液并重新给药。反复吹打后收集细胞悬浮液，室温800 r/ min 离心5 min，弃去上清液。用 PBS 溶液（pH7.4）洗涤3 次，800 r/ min 离心5 min 后用2.5%戊二醛吹散并置于4 ℃过夜。第2 天室温800 r/ min 离心5 min，收集细胞沉淀，用PBS 溶液（pH7.4）洗涤3 次，800 r/ min 离心5 min。使用2%琼脂粉包埋细胞沉淀，修切包埋块后用PBS 清洗3 次，800 r/ min 离心5 min。用1%锇酸固定2 h，每次PBS 洗涤3 次，每次洗涤30 min；用不同浓度梯度的乙醇进行脱水处理，每次脱水20 min。脱水后的样品用树脂与丙酮渗透4 h，然后在纯树脂中渗透过夜；将样品在聚合反应器中聚合，重新包埋后用LKB-V 超薄切片进行切片，后将超薄切片用乙酸双氧铀-柠檬酸铅染色，自然干燥后在透射电子显微镜下观察、拍照。

1.4 流式细胞仪分拣Annexin V-FITC/PI 染色的凋亡细胞

将sf9 细胞铺满6 孔板的90 %，用AZA 处理细胞处理方式同透射电镜检测；使用细胞刮刀轻轻刮取细胞，800 r/min 离心5 min 收集细胞沉淀；用预冷的PBS 洗涤细胞沉淀2 次，800 r/min 4 ℃离心5 min，弃上清。使用500 μL 的Binding Buffer 悬浮细胞，用5 μL Annexin V-FITC 和5 μL PI 混匀后轻轻吹打细胞后避光，室温反应10 min。最后使用流式细胞仪检测Annexin V-FITC的绿色荧光和PI 的红色荧光。

1.5 Western blot 检测蛋白表达

5 mmol/L AZA 处理sf9 细胞48 h 后，对照加入1‰ DMSO 的细胞培养液，用PBS 洗涤3 次，用RIPA 提取总细胞蛋白，BCA 试剂盒进行蛋白定量，加入4×蛋白质上样缓冲液。煮沸5 min，分装后于-20 ℃冰箱保存待用。将约20 μg 蛋白质进行SDS-PAGE 电泳，并将蛋白质转移至PVDF 膜。将10%脱脂奶粉封闭2 h 后，将一抗于4 ℃摇床上孵育过夜，用PBS 洗涤膜，加入辣根过氧化物酶标记的二抗，并用ECL 发光试剂盒测试。使用Image Pro4.5 图像分析软件进行灰度扫描，分析每个条带的灰度值，以β-Tubulin作为内部参考。分别以Phospho-FOXO、Cleaved Caspase-3、Bim 和β-Tubulin 进行灰度比值计算作半定量分析。

1.6 RNA 提取和qRT-PCR

用TRIzol试剂提取sf9细胞的总RNA，通过试剂盒合成cDNA。使用SYBR Green Master MixqPCR定量试剂盒测定FOXO和α-tubulin的m R N A 表达水平。引物序列如下：F O X O（F:5'-GGATGTGCATTCTATGGTGTACC -3';R:5'-TTTCGGGATTGCTTTATCTCAGAC -3'）,α-tubulin（F:5'-CGCATTCATGGTTGATAACG-3';R:5'-GGGCACCAAGTTAGTCTGGA -3'），基因相对表达量采用2-ΔΔCt法测定［22］，重复3次。

1.7 双链RNA 合成及Caspase-3 酶活检测

通 过T7 RNAi 系 统（RiboMAXTM）合 成dsRNAFOXO，用 LipofectamineTM2000 转 染 sf9细胞。转染 dsRNAFOXO后，收集 AZA 处理的sf9 细胞利用Caspase-3 酶活检测试剂盒测定其活性。800 r/min 离心5 min 收集细胞，PBS 洗涤细胞3 次，加入RIPA 裂解缓冲液提取细胞总蛋白。随后使用 BCA 试剂盒测定蛋白浓度，将蛋白溶液与Caspase-3 的特异性发光底物在37 ℃避光孵育4 h，在405 nm 处测定光密度。

试验数据使用SPSS 19.0 单因素方差分析（SPSS，Chicago，USA）进行差异显著性测验。

2 结果与分析

2.1 印楝素抑制sf9 细胞增殖

CCK-8 法检测结果表明，AZA 在体外对草地贪夜蛾卵巢细胞的增殖有明显的抑制作用。作用48 h 后，细胞活力随AZA 浓度的增加而显著降低（图1A），呈明显的浓度依赖性。当AZA 在较低浓度0.625 mmol/L 时，细胞活力为95.32%；当AZA 处理浓度为5 mmol/L 时，细胞存活率为67.31%，将该浓度用作后续试验的处理浓度。进一步用5 mmol/L 的AZA 处 理sf9 细胞24、48、72、96 h 后发现，细胞活力随处理时间的延长而呈下降趋势（图1B）。由此可见，AZA 对sf9 细胞的抑制作用呈明显的时间和浓度依赖性。

2.2 印楝素破坏sf9 细胞的微观结构

用5 mmol/L AZA 分别处理sf9 细胞0、24、48、72 h，从结果（图2）可以看出，AZA 处理0 h 细胞结构完整，细胞核较大核膜清晰可见，染色质分布均匀，可见明显的细胞器。当AZA 处理24 h 后，细胞核收缩，染色质聚集，细胞质呈空泡状；处理48 h 后，细胞空泡化增加，细胞膜收缩，染色质聚集更严重，细胞变形;处理72 h 后，细胞核的染色质聚集成大颗粒并沿核膜分布，细胞骨架破损，细胞变形不能维持正常的稳态，细胞崩解逐级走向死亡。表明印楝素可破坏草地贪夜蛾卵巢细胞的超微结构。

2.3 印楝素诱导sf9 细胞凋亡

根据Annexin V-FITC/ PI 联用的流式细胞分拣原理，其检测能够将样本中的正常细胞（图3A左下）、死亡细胞（图3A 左上），早期凋亡细胞（图3A 右上）和中晚期凋亡细胞（图3A 右下）分类和统计，获得的结果可以更好地计算细胞凋亡率。根据统计结果（图3B），可看出随AZA 处理时间延长，早期凋亡细胞比率增加。处理0 h为1.09%，处理24 h 为14.83%，处理48 h 为23.81%，处理72 h 为46.94%，不同处理间差异显著，即AZA 诱导的sf9 细胞凋亡率与时间呈正相关。

2.4 印楝素通过上调FOXO 基因诱导sf9 细胞凋亡

用5 mmol/L AZA 处理sf9 细胞48 h 后，与对照相比凋亡蛋白Bim 和Cleaved-Caspase-3 的表达水平显著增加（图4A、B）。FOXO 总蛋白表达无明显差异，但P-FOXO 蛋白表达显著低于对照。表明AZA 可抑制sf9 细胞中FOXO 蛋白的磷酸化水平，从而诱导凋亡。进一步利用qRT-PCR 检测发现，FOXO基因的表达量与AZA 处理时间呈正相关，在此基础上通过RNAi 技术降低FOXO基因在sf9 细胞中的表达量，经AZA 处理后发现Caspase-3 的酶活性显著降低。表明AZA 可通过上调转录因子FOXO的表达而诱导sf9 细胞凋亡。

3 讨论

印楝素是目前世界公认的活性最强的拒食剂和昆虫生长调节剂，是最优秀的生物农药之一。印楝素处理后，昆虫不能正常蜕皮，停滞在幼虫-蛹中间体或永久幼虫状态［13］。大量实验证明，印楝素可导致草地贪夜蛾、斜纹夜蛾和粉纹夜蛾等昆虫离体细胞的线粒体膜电位降低，引起细胞凋亡［23-24］。早在1993 年，Rembold 和Annadurai曾报道印楝素可影响草地贪夜蛾卵巢细胞sf9 的增殖和蛋白合成［25］。本研究采用CCK-8 方法证实了AZA 可抑制草地贪夜蛾卵巢细胞的增殖，且呈现时间和浓度的依赖性。透射电镜发现sf9 细胞的微观结构发生明显变化，即细胞核发生变形和皱缩，染色质聚集，细胞质空泡化；流式细胞凋亡率检测表明，凋亡细胞与处理时间呈正相关，提示AZA 抑制sf9 细胞增殖，促进细胞凋亡，与前期研究结果一致。

细胞凋亡受细胞内各种分子调节，FOXO 属于叉头转录因子家族，在细胞凋亡中起重要作用［26］，可被PI3K/Akt 信号通路调控，该通路与细胞生存密切相关。FOXO 为Akt 的下游底物，激 活Akt 使FOXO 的Thr32、Ser253 及Ser315 三个位点发生磷酸化，并从细胞核转运至细胞质，不发挥其转录因子的作用；反之，当Akt 的活性下降时，FOXO 的磷酸化水平下降，非磷酸化的FOXO 可移位进入细胞核，发挥其转录活性，诱导靶基因的转录［27］。Bim 蛋白是Bcl-2 凋亡相关蛋白家族中仅含有BH3 结构域的促凋亡蛋白，是FOXO 诱导的重要靶基因，转录因子FOXO 可结合于Bim 的启动子上调控Bim 的表达。Bim 表达上调促进线粒体释放细胞色素c 及Caspase 的激活，从而导致细胞凋亡［28-29］。本研究显示，AZA 作用sf9 细胞后，FOXO 总蛋白水平没有显著变化，但磷酸化水平降低，靶基因Bim 的蛋白表达量增加，Cleaved Caspase-3 蛋白的表达水平上升，说明印楝素通过降低sf9 细胞中FOXO基因的磷酸化水平，使其发挥其转录因子活性，进而诱导FOXO 的靶基因促凋亡蛋白Bim 表达量升高，该蛋白表达量升高导致Caspase-3 的激活。为验证这一结论，本研究在此基础上，利用RNAi技术降低sf9 细胞中FOXO基因表达，AZA 处理后发现Caspase-3 活性显着降低，证实转录因子FOXO可调控AZA 诱导的sf9 细胞凋亡。然而，由AZA 控制的细胞的凋亡过程非常复杂，涉及多个信号通路和生物过程，其分子机制仍需进一步研究。

4 结论

本研究以草地贪夜蛾卵巢细胞sf9 为研究对象，探讨了印楝素对sf9 细胞增殖的影响及其作用机理。结果表明，印楝素对sf9 细胞有明显的增殖抑制作用，且呈明显的时间和浓度依赖性。透射电镜观察到5 mmol/L AZA 可破坏sf9 细胞的微观结构，导致细胞核收缩，染色质聚集，细胞质空泡状；进一步通过流式细胞仪检测发现，AZA 可诱导sf9 细胞凋亡并与处理时间呈正相关；分子生物学实验发现AZA 可使sf9 细胞中FOXO 蛋白的磷酸化水平降低，靶基因促凋亡Bim 和Cleaved Caspase-3 的表达量增加；进一步利用RNAi 技术沉默FOXO后，经AZA 处理发现Caspase-3 的酶活性显著降低。表明印楝素可通过上调FOXO的表达而诱导草地贪夜蛾卵巢细胞凋亡。