储粮害虫网翅鳞虫齿的形态与DNA条形码鉴定

邓温歆 崔纪翔 冯士骞 粟 耘 陈 暄 陈明华 张 涛 李志红

(1 中国农业大学植物保护学院植物生物安全系 100193) (2 北京市昌平粮食收储库 102200) (3 国家粮食和物资储备局科学研究院 100037)

啮总目(Psocodea)中部分物种是全球广泛关注的仓储害虫，它们危害储粮，极大降低了粮食的品质[1,2]。此外，该类害虫可传播病原微生物，导致储粮污染严重，并可能导致人类产生过敏反应[3,4]。因此，啮虫被认为是全球食品安全的一种生物风险[5]。危害储粮的啮虫主要属于书虱科(Liposcelididae)的书虱属(Liposcelis)和窃虫齿科(Trogiidae)的鳞虫齿属(Lepinotus)[6]。截至目前，鳞虫齿属已报道12种[7]；其中，网翅鳞虫齿(LepinotusreticulatusEnderlein)在中国云南省及浙江省已有记录[8,9]；其在浙江省为野外记录，在云南省为粮库环境中的记录。啮虫可随粮食的运输而扩散，作为储粮害虫防治的基础性工作，啮虫种类的准确鉴定尤为重要。

由于储粮啮虫个体微小、近似种之间的形态差异细微，基于传统形态学的种类鉴定需要一定的专业知识与技巧[10]。随着分子生物技术的快速发展，DNA条形码被运用于生物物种鉴定，基于mtDNA COΙ条形码，可快速、准确鉴定出未知动物样品的种类[11]。其中，Folmer等[12]设计了可扩增无脊椎动物mtDNA COΙ基因的通用引物，已被广泛应用。针对网翅鳞虫齿，2012年中国农业大学报道了网翅鳞虫齿在中国的新纪录[8,9]；此外，Mohammad Arif等[13]基于普通PCR、SYBR Green qPCR以及HDA(helicase dependent amplification)的方法，对网翅鳞虫齿的COΙ基因进行扩增，更加快速、灵敏地鉴定出该物种。到目前为止，在NCBI网站中，鳞虫齿属中包括网翅鳞虫齿(Lepinotusreticulatus)及帕特鳞虫齿(Lepinotuspatruelis)两个物种，共12条mtDNA COΙ基因序列可供下载并使用。除此之外，窃虫齿亚目中包括窃虫齿科、跳虫齿科和鳞虫齿科均有代表性的物种的mtDNA COΙ基因序列可供下载并使用。

本研究基于形态学与DNA条形码相结合的方法，对采集自北京市昌平区某粮库的啮虫样品进行了鉴定，鉴定结果为网翅鳞虫齿。本研究实现了对网翅鳞虫齿的快速、准确鉴定，是该虫在北京地区的首次报道。

1 材料与方法

1.1 试验材料

研究所用啮虫样品于2019年6月采集自北京市昌平区某粮库的准低温稻谷仓。样品液浸于100%乙醇，置于-20℃冰箱保存于中国农业大学植物检疫与入侵生物学实验室(CAUPQL)。

1.2 仪器与设备

K-400L体视显微镜：香港生产；CX31光学显微镜：日本生产；EOS500D相机：日本生产；H2O3-PROIII金属浴仪：北京生产；Q5000核酸浓度检测仪；Veriti TM 96-well Thermal Cycler (ABI USA)型PCR仪：美国产。

1.3 试验方法

1.3.1 形态学鉴定 形态学整体照片使用液浸样品，浸泡在100%酒精中，于OLYMPUS CX31显微镜下镜检并使用Canon EOS500D进行拍照。细节照片使用活虫压制玻片标本，方法为将样品浸泡于乳酸6 h，充分释放内容物，取出后用清水漂洗。在载玻片中央滴1滴霍氏液并将样品置于霍氏液中。在体视显微镜下，用解剖镊整姿后盖上盖玻片。静置10 min，玻片标本于70℃金属浴上加热5 min。待自然风干两周后于OLYMPUS CX31显微镜下镜检并使用Canon EOS500D拍摄重要形态学特征照片。照片标尺基于ImageJ 1.8.0添加[14]。

相关形态学鉴定特征参考梁飞扬等[8]。

1.3.2 DNA提取 对啮虫样品的基因组DNA提取选用TIANamp Micro DNA Kit试剂盒，参照试剂盒的使用说明进行单头提取，共提取4头样虫。应用Quawell Q5000核酸浓度检测仪检测所提取DNA的浓度和纯度，并置于-70℃保存。

1.3.3 PCR扩增及序列测定 选取mtDNA中的COΙ基因作为DNA条形码进行PCR扩增。扩增引物参考Folmer等[12]，LCO1490(5′-GGTCAATCATAAAGATATATTGG-3′)，HCO2198(5′-TAAACTTCAGG-GTGAAAAAATCA-3′)。PCR反应在Veriti TM 96-well Thermal Cycler型PCR仪中完成。PCR体系选用25 μL体系：2×Taq PCR MasterMix 12.5 μL，ddH2O 9.5 μL，前、后引物各1.0 μL 及基因组DNA模板1.0 μL。扩增条件为：94℃预变性3 min，94℃变性30sec-52℃退火30sec-72℃延伸30sec为1个循环，共设置35次循环，72℃补齐10 min，14℃保存PCR产物[15,16]。针对PCR产物，使用1.5%琼脂糖1×Tris Acetate-EDTA凝胶电泳，使用Gene Green Nucleic Acid Dye为染色剂，选用D2000 Marker为参考条带长度，在Gel Logic 212 PRO型紫外灯下检测PCR产物的扩增结果。全部PCR产物由北京进行双端一代测序。

1.3.4 序列分析 所测序列基于Chromas检测其质量[17]，并应用MEGA 7拼接并去除引物序列[18]。应用MEGA 7基于MUSCLE将所测序列与同源序列进行比对后剪切至合适长度[20]，上传剪切后序列至GenBank获得Accession number。基于NCBI中BLAST功能与nt数据库进行相似性比对。GenBank中下载网翅鳞虫齿同属及相关物种的同源序列(表1)，窃虫齿亚目中每个属选取1个物种作为代表，用于系统发育树分析。由于11条已知网翅鳞虫齿的COΙ序列之间相似度高于96%，因此随机选取一条COΙ序列作为该种的代表参与系统发育树的构建。参考Yoshizawa等[19]，粉虫齿亚目的嗜虫书虱和嗜卷书虱被选取为外群用于进行窃虫齿亚目相关仓储害虫的系统发育分析。应用MEGA 7基于Kimura 2-Parameter模型对COΙ序列进行对偶遗传距离计算，并构建Neighbor-joining(NJ)系统发育树，设置自我检测1000次，结果标注于拓扑结构相应节点旁。

表1 网翅鳞虫齿及相关物种用于系统发育分析的相关序列信息

2 结果与分析

2.1 形态鉴定结果

啮虫样品玻片标本显示，该样品雌虫体长约1 mm(图1a)。头红褐色，胸部和腹部为黄褐色，无单眼和头盖缝臂。复眼上具2根刚毛，其中一刚毛仅剩毛窝(图1b)。内颚叶顶端具2齿，外侧为大齿，内侧为小齿(图1c)。该样品仅具1对前翅，翅脉网格状，多毛(图1a,d)，无后翅。后足胫节具2尖刺(图1e)，跗节3节，第一跗节上无刺。近肛门处，肛侧板上具一长刚毛(图1f)。雌虫生殖突外瓣发达，具几根细小刚毛，顶端具一长刚毛(图1g)，无受精囊。以上形态特征与已有描述相符，基于形态学观察结果，所采集的啮虫样品可被鉴定为网翅鳞虫齿。

a成虫背面观

b复眼

c内颚叶顶端

d前翅

e后足胫节、跗节

f肛侧板

g生殖突外瓣

2.2 分子鉴定结果

PCR产物经凝胶电泳检测结果如图2所示，COΙ基因扩增结果条带清晰，片段长度约为700 bp。

注：M为D2000 Marker，1～4为4头样虫，5为阴性对照

经测序得到长度为683 bp的高质量COΙ序列4条(MW134455-MW134458)。其与已知网翅鳞虫齿的mtDNA COΙ序列的BLAST结果如表2所示，E value为0，相似度为97.26%～99.24%。基于Kimura 2-Parameter模型对COΙ序列进行对偶遗传距离计算结果见表3，样品与已知网翅鳞虫齿同源序列间K2P对偶遗传距离范围最小，为0.012～0.020。在基于邻接法(NJ)构建的系统发育树中，4头啮虫样品均与已知网翅鳞虫齿样品聚在同一支(图3)，能够与窃虫齿亚目其他种群明显区分。基于以上结果，所采集的啮虫样品为网翅鳞虫齿。

表2 基于COΙ条形码的啮虫样品与网翅鳞虫齿的BLAST结果

表3 基于COΙ条形码的啮虫样品与相关物种对偶遗传距离计算结果

图3 邻接法(NJ)构建啮虫样品及其相关物种系统发育树

3 讨论

网翅鳞虫齿是一种个体微小、短翅、能够孤雌生殖的仓储害虫[21-23]，也能在室外的地面垃圾、鸟类及哺乳动物巢中，甚至鸟类羽毛中偶然发现该虫[9]。本研究基于形态学鉴定方法，对采集自北京市昌平区某粮库的啮虫样品进行形态学观察，并对其形态学特征进行了详细描述，样品被鉴定为网翅鳞虫齿。同时，基于DNA条形码鉴定方法，啮虫样品的mtDNA COΙ条形码序列被测定，比对了相似度，并被基于Kimura 2-Parameter模型计算对偶遗传距离，构建了系统发育树。最终，分子鉴定结果支持形态学观察结果，即所采集的啮虫样品是网翅鳞虫齿。

DNA条形码技术依据简短且标准化的基因序列进行物种鉴定，其准确性的高低取决于已有基因库的丰富程度[24]。mtDNA COΙ作为一种典型的模式条形码，已较为广泛地用于未知物种的分子鉴定[23]。鳞虫齿属的不同种类间，由于虫体微小，形态特征差异细微，形态鉴定有较大难度。DNA条形码鉴定可以克服啮虫处于不同生长阶段，形态特征差别细微所导致的鉴定困难，即能够快速、准确地鉴定各虫态的啮虫样品。

到目前为止，在NCBI网站中，鳞虫齿属仅有12条mtDNA COΙ基因序列可供下载与使用。在GenBank及BoldSystems等多种数据库中，所包含鳞虫齿属的mtDNA COΙ序列具有一定的重合，但仍有部分序列未同步。此外，数据库中上传的mtDNA COΙ基因序列之间长度不一致，这可能为鳞虫齿属的准确鉴定带来不便。为进一步提高DNA条形码鉴定结果的准确性，随着鳞虫齿属在世界范围内新纪录的增加，应尽量增添该属不同种和种群的mtDNA COΙ序列检测结果，同时统一序列长度范围并在多数据库中同步更新，以提高多数据库中该基因的丰富程度。

针对网翅磷虫齿的生物学特性、危害特点以及在粮库中的发生规律和致害机制，有待进一步研究。在本研究中，网翅磷虫齿被发现于经过熏蒸的准低温稻谷仓中。有学者曾针对其食物偏好性及种群增长特点进行过报道[23]。为了实现储粮啮虫的绿色可持续防治，未来应进一步加强网翅磷虫齿对熏蒸剂和低温的耐受能力及其机制的研究。