金沸草HS-GC-MS指纹图谱研究*

王珊珊，周蕊，李晋，何俊，常艳旭

（天津中医药大学，天津市现代中药重点实验室，天津 301617）

金沸草为菊科植物条叶旋覆花Inula linariifolia Turcz.或旋覆花Inula japonica Thunb.的干燥地上部分[1]，具有降气、消痰、行水之功效[2]。文献报道，金沸草主要含有萜类和黄酮苷类化合物，具有抗炎、抗真菌、抗肿瘤等药理作用[3-5]。倍半萜内酯类是其特征性成分，研究表明金沸草含有ivangustin、泽兰内酯、1-乙酰氧基大花旋覆花内酯等倍半萜类成分[6-8]。有学者采用HPLC方法测定了金沸草中五个倍半萜类成分的含量，其中1-乙酰氧基大花旋覆花内酯含量较高且具有抗炎药理活性[9-10]。金沸草在中医临床上多用于治疗疮疡、咳嗽等疾病[11-12]。目前，金沸草头状花序研究较多，已采用气相色谱-质谱联用技术（GC-MS）开展了挥发油定性研究[13-14]，但有关的金沸草地上全草的挥发性成分的研究未见报道。本文对来自不同产地、不同批次金沸草的挥发油进行系统研究，以期对金沸草的药材品质进行系统评价。

静态顶空分析（HS）属于顶空进样方式的其中一种，操作简便且无需有机溶剂的参与，通过与色谱仪联用可实现对挥发性成分的定性和定量分析[15]。GC-MS能够高效灵敏的识别和分析复杂的化学成分[16]。顶空分析与气相质谱技术（HS-GC-MS）联用技术已经在食品、环境和生物样品检测等领域得到了广泛应用[17-19]。中药指纹图谱技术是在整体上对中药材进行综合和量化的客观分析，从而评价中药材的真伪优劣及稳定性[20]。本文采用HS-GC-MS联用技术对不同产地、不同批次的金沸草药材的挥发性成分进行研究，建立挥发性成分的指纹图谱体系并确定其共有峰成分，为金沸草的质量标准规范的制定及药效物质研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与设备 金沸草药材分别购自于安徽、贵阳、河北等地，样品产地详情见表1，经天津中医药大学常艳旭研究员鉴定其均为菊科植物旋覆花（Inula japonica Thunb.）。

表1 22批金沸草的产地来源

GC-MS为日本岛津GC-MC QP2010，顶空进样器意大利DANI HSS 68.50（意大利丹尼），DB-5MS（0.25 mm，0.25 μm，30 m）弹性石英毛细管柱。

1.2 供试品的制备 取适量金沸草饮片粉碎，过50目筛，精密称量样品2.00 g置于顶空进样瓶中，并立即封口。

1.3 HS-GC-MS分析条件 静态顶空条件：进样器加热炉炉温100℃，进样系统温度120℃，传输管线温度140℃，加热时间为30 min。

气相色谱条件：初始温度50℃保持1 min，以5℃/min速率升温至225℃后以15℃/min速率上升至250℃。进样口温度为250℃，线速度控制流量，柱流量为1.2 min/mL，分流模式，分流比为5。

质谱条件：接口温度280℃，离子源温度230℃，溶剂延迟时间1min，全扫描SCAN模式，间隔时间为0.3 s，扫描范围40～600 m/z，检测器电压为1.3 kV。

2 结果与讨论

2.1 金沸草挥发性成分定性分析 采用HS-GCMS技术检测金沸草药材中的挥发性成分，其气相质谱总离子流图（TIC）如图1所示，各色谱峰表明金沸草药材中含有的挥发性成分复杂多样。参照NIST08质谱数据库对金沸草TIC图进行相似度检索，筛选出匹配率不低于80%的色谱峰，最终定性出104种化学成分，并采用峰面积归一化算法计算各挥发性成分的相对百分含量，见开放科学（资源服务）标识码表2。发现金沸草药材含有的挥发性成分主要包括萜类、醛类两大类成分。其中萜类化合物有43种，相对含量为22.4%，包括萜烯24种（12.22%）、萜醇 11种（3.88%）、萜酮 6种（4.58%），萜醛3种（1.72%），其中以萜烯成分为主；醛类化合物有12种，其相对含量最高且占所检测挥发性成分的42.01%，以2-甲基丁醛为主。除此之外，还含有醇类8种（5.92%）、芳香族化合物7种（3.75%）、烷烃类6种（5.08%）、烯酮类10种（4.76%）、呋喃类5种（8.18%）、有机酸5种（4.93%）、酯类4种（2.17%）、其他类3种（0.8%）。

图1 金沸草HS-GC-MS总离子流图

由于地理位置、生长环境等因素，不同产地间金沸草的挥发性成分含量存在明显差异。由图2所示，十类不同产地的样品中化合物均以萜、醛类为主，其中醛类成分在湖南（S18）产地相对含量最高，江苏产地最低。萜类成分在河南产地与安徽产地的相对含量相近，比例较高。酯类成分在四川（S21）产地中相对含量较好。醇类化合物在江苏（S19）产地中所占比例较高。其余化合物在不同产地间的相对含量差异性较小。安徽（S1-S5）产地的五个不同批次间萜类与醛类的相对含量差异较大，这可能是由于阳光、土壤、水分等多种环境因素导致的。贵阳（S8-S10）、河南（S11-S16）的批间差异性较小，各类成分的相对含量相近。因此，萜类、醛类和醇类成分是不同产地、不同批次的金沸草挥发油质量的差异成分。

图2 不同产地金沸草中各类成分相对含量分布图

2.2 金沸草指纹图谱分析

2.2.1 方法学验证

2.2.1.1 精密度实验 精确称量2.00 g样品，在“1.3”项条件下连续进样6次，测得共有峰的峰面积的相对标准偏差（RSD）小于4.4%，证明仪器精密度良好。

2.2.1.2 重现性实验 精确称量6份样品，在“1.3”项条件下平行操作6次，测得共有峰的峰面积的相对标准偏差（RSD）小于4.0%，证明方法重现性良好。

2.2.1.3 稳定性实验 精确称量6份样品，在“1.3”项条件下，分别在 0、2、4、8、12 和 24 h 进样分析，测得共有峰的峰面积的相对标准偏差（RSD）小于4.6%，证明样品在24 h内稳定，结果可靠。

2.2.2 金沸草指纹图谱的建立及相似度评价 收集的22批药材在“1.3”项条件下进行HS-GC-MS分析，将各批样品的GC-MS数据导入到“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012版”软件，以S12谱图为参照生成标准指纹图谱（R）如图3所示。

图3 金沸草HS-GC-MS指纹图谱

GC-MS图谱结果显示22批金沸草药材指纹图谱既在整体上具有相似性，又有各自的特征性，表明不同产地、同一产地不同批次的金沸草药材含有的化学成分有所差异。应用夹角余弦计算方法，评价22批金沸草的图谱相似度，计算结果见表3。除了两批相似度为0.835和0.848，其余相似度均在0.945以上。上述研究结果表明，所建立的金沸草药材HS-GC-MS指纹图谱准确可靠，可为金沸草的质量评价提供技术支撑。

表3 22批金沸草药材相似度

2.3 金沸草共有峰分析 根据指纹图谱相似度评价系统对22批药材色谱图的分析，通过比对保留时间是否一致，以及选择经NIST08数据库分析匹配度不低于85%且峰响应值较高的峰作为依据，共指认出13个共有峰，经NIST08数据库对共有峰定性分析的结果见表4。22批药材共有的挥发性成分主要为萜类、醛类、呋喃类及醇类等成分。萜类成分有4种，其中包括3种萜醇和1种萜烯，分别为桉叶油醇、（+/-）-薄荷醇、（-）-4-萜品醇、蒎烯；醛类成分有3种，分别为苯甲醛、正辛醛和癸醛。另外还含有2种呋喃（2-乙基呋喃、2-正戊基呋喃），2种醇类（正己醇、2.6-二甲基环己醇），1种烯酮（甲基庚烯酮）及1种芳香族化合物（邻异丙基甲苯）。

表4 共有峰的定性分析

4 结论

金沸草为传统中药材，具有降逆的中药特性，在临床上发挥着不可或缺的位置。但其化学成分复杂，种类繁多，挥发油产物仍然模糊，质量评价体系还不完善。本研究采用HS-GC-MS分析技术，构建了金沸草挥发性化学成分指纹图谱，定性出104种化学成分，包括萜类、醛类、烯酮、醇类、有机酸及呋喃类等，其中萜类和醛类是其主要挥发性成分。22批药材经GC-MS分析指认出13个共有峰，包括萜类、醛类、醇类及呋喃类等，其中含有3种萜醇和1种萜烯。萜类化合物普遍具有抗炎、抑菌等药理作用[21]。桉叶油醇能够选择性地调节PRR信号通路，下调炎症因子TNF-α、IL-1β和IL-6等表达而表现抗炎活性，同时它可通过减少神经元凋亡、小胶质细胞激活和氧化应激发挥神经保护作用[22-23]。薄荷醇通过MAPK、NF-κB和AKT信号通路抑制神经炎症反应[24]。（-）-4-萜品醇抑制 p38MAPK/NF-κB（p65）信号通路，从而改善小鼠变应性鼻炎和哮喘综合征[25]。蒎烯能够干扰微生物的发育和繁殖，具有明确的抗菌特性[26]。基于这些化学成分的抗炎、抗菌的药理活性，推测其可能与金沸草发挥“降气、消痰、行水”的药效作用有着密切联系。因此，文章建立了金沸草HS-GC-MS指纹图谱，方法学考察表明该指纹图谱稳定、准确、可靠。本研究反映了金沸草药材的挥发性成分的种类与数量，为金沸草药材的质量评价及药效物质基础提供技术。